第4章--基因工程的主要技術(shù)及其原理概要.ppt

1、第四章 基因工程的主要技術(shù)及其原理,第一節(jié) DNA和RNA的提取與純化,一 DNA提取的基本原理與方法,（一）DNA提取的基本原理,DNA的性質(zhì)： DNA是極性化合物，不溶于有機溶劑，溶于水，在水中溶解度達10g/L，其鈉鹽比游離態(tài)更易溶于水。在酸性溶液中易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 DNA與核蛋白復(fù)合體DNP在在低鹽濃度（0.1mol/L NaCl）溶液中溶解度最低（為水中的1%），在高鹽濃度（1mol/L NaCl）溶液中溶解度較高（為水中的2倍），而核糖核蛋白RNP受鹽濃度影響較小，在低鹽濃度中溶解度仍較大。從而可將DNP和RNP分開。,提取和純化DNA，首先需破碎或溶解細胞，用

2、高鹽（1mol/L NaCl）將DNP抽提出來，再把蛋白質(zhì)、多糖、RNA及無機離子除去。,(1). 細胞裂解和DNA的溶解； 一般采用機械破碎或酶解細胞釋放DNA，嚴防細胞中各種酶對DNA的 破壞： 1)利用液氮在超低溫下研磨，使酶失活； 2)快速加入緩沖液并迅速混勻，保護DNA。,DNA提取的步驟：,EDTA：螯合DNA酶的輔助因子Mg2+和Ca2+，降低DNA酶活性； SDS：變性并降解蛋白質(zhì)，降低DNA酶活性； 抗氧化劑：PVP，-巰基乙醇，抗壞血酸、半胱氨酸，DTT降低酚類氧化 對DNA的干擾 PVP：有效去除酚類和多糖物質(zhì)。,(2). 與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)的去除；,主要利

3、用DNA與蛋白、多糖性質(zhì)不同，加入離子變性劑、去污劑使其變性解聚；,CTAB: 十六烷基三甲基溴化銨，可溶解細胞膜，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl） 與DNA結(jié)合形成復(fù)合物并呈溶解狀態(tài)，但當濃度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）時，DNA即從溶液中沉淀，通過離心可將DNA-CTAB復(fù)合物與多糖與 蛋白質(zhì)分開。,SDS: 十二烷基硫酸鈉，可使蛋白質(zhì)變性，核蛋白解聚，使DNA游離出來， 再根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在有機溶劑中溶解度差異，用苯酚-氯仿抽提蛋白。,苯酚-氯仿: 對蛋白質(zhì)具有極強的變性作用，而對DNA無影響。,RNA雜質(zhì): 用不含DNA酶的RNA酶去除。,(3). DNA的

4、沉淀與純化,溶解在上清液中的DNA加入2倍體積的無水乙醇使其沉淀。 在多糖、蛋白含量高時用1倍的異丙醇沉淀效果較好。,（二）DNA提取的幾種方法,根據(jù)細胞破碎后，分離DNA與蛋白質(zhì)所采用的技術(shù)策略和試劑不同，可分以下幾種方法：,1. 濃鹽法 原理：根據(jù)RNP和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。,方法1：用1mol/L NaCl抽提，得到的DNP液中加入含辛醇的氯仿，離心，DNA位于 上層水相，回收水相，用2倍體積的95%乙醇或無水乙醇將DNA沉淀出來。,方法2：用0.15mol/L NaCl反復(fù)洗滌細胞裂解液除去RNP，再用1mol/L NaCl抽提DNP， 然后用氯仿-異戊醇除去蛋白

5、。,以稀鹽溶液提取DNA，可加入適量SDS使蛋白質(zhì)變性解聚，使DNA解離； 使用SSC溶液（ 5mol/L NaCl、0.015mol/L檸檬酸鈉）抑制DNase降解DNA,2. SDS法 原理：SDS使細胞膜裂解，使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與DNA分開， 加入乙酸鉀可使SDS-蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)變成溶解度更小的鉀鹽，使沉淀更加完全。,3. CTAB法 原理：在細胞裂解液中，加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來。再經(jīng)氯仿-異戊醇 抽提除蛋白，即可得到含DNA水相，經(jīng)乙醇或異丙醇沉淀即得到DNA。,4. 苯酚抽提法 原理：苯酚作為蛋白變性劑，同時可抑制DNA酶的降解作用，用苯酚處理細胞勻漿

6、液， 蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，離心分層取水相，多次重復(fù)，合并水相， 用乙醇沉淀，即得到DNA。,5. 水抽提法 原理：利用核酸溶于水的性質(zhì)，用低鹽除去RNA，將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解， 離心后收集上清液，加入固體NaCl調(diào)至2.6mol/L，加入2倍體積的95%乙醇， 然后，分別用66%，80%，95%乙醇及丙酮清洗DNA，經(jīng)干燥后即得DNA樣品。,在強堿環(huán)境中，大分子量的核DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并在高鹽環(huán)境中，核DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但質(zhì)粒DNA仍然呈可溶狀態(tài)。,堿裂解法提質(zhì)粒DNA的原理：,（三）質(zhì)粒的提取,二 RNA提取

7、的基本原理與方法,（一）總RNA提取的基本原理與方法,1. 總RNA提取的原理,真核生物RNA分子主要存在于細胞核與細胞質(zhì)中。 總RNA：rRNA，tRNA，mRNA。其中mRNA僅占總RNA的1- 5% ， 分子大小不等，由幾百乃至數(shù)萬核苷酸組成。,能否成功提取RNA，關(guān)鍵在于能否完全抑制或除去RNA酶的破壞作用， 獲取完整的全長RNA分子。,RNA酶有一條多肽鏈組成，不需要任何輔助因子，存在十分廣泛并十分穩(wěn)定， 非常耐熱，在較寬的pH范圍內(nèi)有活性，及其頑固。,1）所有玻璃器皿應(yīng)置于180烘箱烘烤4小時以上；凡是不能烘烤的材料如塑料制品需用01%的DEPC（二乙基焦碳酸鹽）溶液處理，然后12

8、1 高壓消毒40分鐘； 2) 全部過程需戴手套、口罩操作，并經(jīng)常更換手套； 3) RNA電泳漕需用去污劑洗滌，用水沖洗干凈后，用乙醇干燥，浸泡于3%的H2O2水溶液中，室溫10分鐘后，再用0.1%DEPC水徹底沖洗。,提取RNA的實驗必須采取以下措施：,1）細胞的有效破碎，尤其是植物細胞帶有細胞壁，研磨要徹底； 2) 使核蛋白復(fù)合體充分變性、解離，使核酸釋放到溶液中； 變性劑有異硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸鈉等； 3) 有效地抑制內(nèi)源及外源RNase活性； 4) 將RNA與DNA、蛋白質(zhì)和多糖分開。策略一是先提總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；策略二是直接在酸性條件下用酚-氯仿抽提，低pH的

9、酚將使RNA進入水相，而蛋白質(zhì)和DNA留在有機相中，水相中的RNA可用異丙醇沉淀出來。,提取RNA的方法一般包括4個關(guān)鍵點：,2. 總RNA提取的方法,(1) 酚-異硫氰酸胍提取法。 Trizol試劑是最廣泛的抽提總RNA的試劑，即根據(jù)酚-異硫氰酸胍提取法設(shè)計。,提取步驟： 在液氮中研磨樣品，使細胞破碎 加入Trizol試劑，溶解細胞成分 加入氯仿抽提蛋白，離心分離水相和有機相 收集含RNA的水相 異丙醇沉淀可獲得RNA樣品。,(2) 離心分離法。 過柱純化，將含RNA的細胞破碎液加在含硅膠膜的柱子上，通過柱子時，RNA被 硅膠膜吸附，與其他雜質(zhì)分開，然后在低鹽溶液或水中將RNA洗脫下列。,（

10、二）mRNA的提取,真核生物mRNA的提取途徑有兩條： 其一：抽提細胞總RNA，經(jīng)蛋白酶K除蛋白，在利用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸纖 維 素柱層析，把mRNA與tRNA、rRNA分開。 真核生物mRNA的3末端帶有一串長約200個腺苷酸的polyA序列，其他RNA 沒有這樣的結(jié)構(gòu)，從而可用polyT將mRNA結(jié)合將其分離。,基因表達具有時空特異性，分離與目的基因時空表達相對應(yīng)的mRNA是實驗成 功的關(guān)鍵。,其二：先提多聚核糖體，再將蛋白質(zhì)與mRNA分開，利用抗原抗體反應(yīng)，將微量 特異的mRNA提取出來。,二 DNA或RNA濃度、純度和相對分子質(zhì)量的測定,常用的方法有紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法

11、。,（一）紫外分光光度計法測定DNA、RNA的濃度和純度,DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)具有較強吸收，吸收峰在260nm處。 1個OD260相當于50ug/mL的雙鏈DNA； 1個OD260相當于40ug/mL的單鏈RNA；,蛋白質(zhì)的最大吸收峰在280nm處，多糖的最大吸收峰在230nm處。,對于DNA，OD260/OD2801.8，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明 有蛋白質(zhì)、苯酚等的污染。 對于RNA, OD260/OD280=1.82.0之間，小于1.7表明有蛋白質(zhì)和苯酚污染， 大于2.0表明有異硫氰酸胍殘留。,（二）瓊脂糖凝膠電泳鑒定,采用瓊脂糖凝膠電泳可以粗略鑒定D

12、NA和RNA的含量和純度。,EB(溴化乙錠）：DNA的染色劑。該物質(zhì)能嵌入核酸分子，并具有在紫外光下 發(fā)熒光的特性。,利用EB染色的DNA樣品的亮度可粗略定量，而通過條帶的清晰度判斷是否降解 如果DNA有降解，則在電泳圖譜上表現(xiàn)出明顯的拖尾。,一般用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。,第二節(jié) 凝膠電泳,DNA的等電點偏酸，當處于電泳條件（pH=8）時，DNA鏈上帶有負電荷，在電場力的作用下會向正極泳動，由于DNA鏈上負電荷的增加伴隨著DNA分子質(zhì)量的增加而增加。所以，實際上DNA分子的荷質(zhì)比始終是一常數(shù)，電泳中分離DNA靠的是分子的大小與構(gòu)型的不同。,一 瓊脂糖凝膠電泳,（一）瓊脂糖凝膠

13、,瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持介質(zhì)，在適當條件下對帶電生物大分子進行分離。 瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，是D-半乳糖和脫水3,6-L-半乳糖連接而成的一種線性 分子，具有親水性，不帶電，不引起DNA變性，不吸附分離物質(zhì)的特點。,凝膠的分辨能力與凝膠的類型和濃度有關(guān)。,不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小范圍,（二）凝膠電泳的影響因素,1、 DNA的分子大小。 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。,2、 DNA的分子構(gòu)型。 相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,

14、 超螺旋DNA移動最快,而開環(huán)DNA分子移動最慢 。,3、 凝膠濃度。 一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。,4、 電場強度。 電壓一般不超過5v/cm ，電壓高，電泳快，但分辨率低。電壓低，電泳慢，但分辨率高。,5、 溴化乙錠。 熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15。,6、 電泳緩沖液。 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤

15、用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小, DNA幾乎不移動, 在高離子強度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液), 則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱, 嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性 。,二 瓊脂糖變性膠電泳,RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)堿基容易配對形成二級結(jié)構(gòu)。不同的RNA分子空間結(jié)構(gòu)不同，在未變性條件下，其相對分子量與電泳一定距離沒有嚴格的相關(guān)性。,常用的RNA變性膠有兩種： 其一為含有乙二醛-二甲基亞砜（DMSO）的凝膠； 其二為含甲醛的凝膠。,水平電泳,三 聚丙烯酰胺凝膠電泳,垂直電泳,聚丙烯酰胺凝膠，既具有分子篩效應(yīng)，又具有靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊脂糖凝膠，可達一個核苷酸。同時又可用于蛋白質(zhì)的分離。,聚丙烯酰胺凝

16、膠是由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。 常用的催化方法有化學(xué)聚合和光聚合： 化學(xué)聚合需加入催化劑過硫酸銨(AP）和加速劑四甲基乙二胺（TEMED)。 光聚合是核黃素在光照射下及有微量氧存在時產(chǎn)生自由基使凝膠聚合。,聚丙烯酰胺凝膠制備在玻璃板上或玻璃管中。 電泳漕分上漕和下漕，各裝有電極，通過凝膠使它們連成導(dǎo)電的整體。 電泳中帶有電荷的分子在電場作用下移動，移動速度依賴于電場強度、分子凈電荷以及分子的大小和形狀，同時也與介質(zhì)的離子強度、黏度和溫度有關(guān)。,四 脈沖場凝膠電泳,常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，在一定的分子量范圍內(nèi)DNA片段泳動速率與分子量大小呈線性關(guān)系，但當DNA分子

17、大小超過凝膠孔徑，DNA分子將由無規(guī)則卷曲的構(gòu)象沿電場方向伸直，變成與電場平行以通過凝膠空隙，這樣大分子通過凝膠的速率無差別，因此無法區(qū)分。,脈沖電場電泳是一種交替變換電場方向的電泳，以一定的角度并以一定的時間變換電場的方向，使DNA在微觀上按“Z”形向前泳動，從而區(qū)分不同大小的DNA分子。,脈沖場電泳可區(qū)分50kb或100kb以上的大片段DNA分子。,五 凝膠電泳中DNA的檢測,凝膠中DNA的檢測方法主要有三種：,EB染色，然后在紫外燈下觀察，主要用于瓊脂糖凝膠； 銀染顯色法，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳； 放射性同位素標記發(fā)，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。,第三節(jié) 核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交,核酸分子雜交

18、原理：雙鏈DNA或具有二級結(jié)構(gòu)的RNA變性后，其具有互補序列的兩條單鏈的退火或復(fù)性過程。 形成的分子有DNA/DNA,DNA/RNA雜合分子形式。,一 探針的標記,探針：是指用于檢測特定基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在或表達的DNA、RNA或寡核苷酸序列，這些序列使用前需要標記。 標記：同位素標記， 生物素、地高辛或辣根過氧化物酶等標記,（一）探針的制備,（1）切口平移法標記,通過復(fù)制合成新探針分子，在復(fù)制過程中摻入標記核苷酸,從而使整個分子被均勻標記。 特點：均勻標記，探針信號強。,均勻標記,（2）隨機引物法,（3）PCR擴增標記,利用6個核苷酸的隨機引物在Klenow酶的作用下，對待檢測的DNA進行隨機

19、擴增，在擴增產(chǎn)物中加入32pdATP，擴增產(chǎn)物用作探針,在PCR擴增時加入標記的dNTP，可獲得大量探針。,2. 末端標記,直接將探針分子的某個原子替換成放射性同位素原子，或直接在探針分子加上標記的原子或復(fù)合物。這種標記一般在探針分子的末端進行，故稱為末端標記。,（1） DNA片段的末端標記 a. 黏末端的補平反應(yīng)或平末端的置換反應(yīng)引入標記的核苷酸； b.T4多核苷酸激酶在DNA的5末端引入標記的磷酸基團； c. 末端轉(zhuǎn)移酶在DNA的3末端連接標記的核苷酸。,（2）. 寡核苷酸的標記 用DNA聚合酶，以合成的更短的寡核苷酸作引物，或合成兩個部分互補的寡核苷酸使之互為模板，在DNA合成的過程中引

20、入標記的寡核苷酸。,（二）標記物及其檢測,同位素,非同位素標記有：生物素標記，地高辛標記和辣根過氧化物酶標記等。,地高辛標記由德國Roche公司開發(fā)，將DIG與dUTP交聯(lián)，在摻入核苷酸標記反應(yīng)中引入DIG-11-dUTP，使DNA或RNA被DIG標記。雜交后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛單抗與標記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍色的沉淀。,生物素是一種水溶性維生素，可通過丙烯鍵與嘧啶的C5位共價結(jié)合，形成biotin-11-dUTP，顯色原理同DIG 。,辣根過氧化物酶（HRP)標記的探針是通過HRP與帶正電荷的聚乙烯亞胺交聯(lián)產(chǎn)生帶正電荷的復(fù)

21、合物，再與帶負電荷的單鏈或雙鏈DNA結(jié)合形成共價鍵，產(chǎn)生酶標記探針，酶可使無色底物顯色，從而進行檢測 。,二 Southern雜交,Southern雜交示意圖,三 Northern雜交,總RNA或mRNA甲醛變性瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交雜交（變性探針） 洗膜放射自顯影或顯色,四 菌落或噬菌斑雜交,菌落原位雜交示意圖,五 Western雜交,第四節(jié) 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù),一 PCR技術(shù)原理,PCR( Polymerase Chain Reaction):一種在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下利用DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。,DNA的體外復(fù)制,高溫變性: 92-96 低溫退火: 37-7

22、2 適溫延伸: 72,（一） PCR技術(shù)的基本過程,n次循環(huán)后雙鏈DNA在 理論上的最高值為2n,（二） 平臺期與平臺效應(yīng),平臺效應(yīng)形成與下列因素有關(guān)：,平臺效應(yīng)：PCR反應(yīng)經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的指數(shù)積累趨于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，而是進人線性增長或靜止期。,（1）引物、dNTP快速摻入底物中，其濃度降低，摻入速度減慢； （2）隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降； （3）非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物競爭； （4）產(chǎn)物的再結(jié)合。,PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖,二 PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)需用一定的條件才能完成，這些條件主要指：,10緩沖液（Mg2+） DNA模板 dNTP(dA

23、TP,dTTP,dGTP,dCTP) 一對引物 DNA聚合酶(Taq酶） 無菌水（補足體系用）,（一）TaqDNA聚合酶,以單鏈DNA為模板，以引物為起點，按53方向合成新生互補鏈 無35外切酶活性 耐高溫（95 C） 最適合成DNA溫度為72 C,（二）引物,引物長度(16-30bp),防止一對引物內(nèi)及引物之間同源性，避免形成引物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或“二聚體” GC含量為40%-60%，兩引物的Tm值相近， Tm = 2（A+T）+ 4（G+C） 引物3端不能進行修飾或形成二級結(jié)構(gòu)； 引物的5端可進行修飾，如添加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等 引入突變位點、插入或缺失突變序列等。,（三）PCR

24、反應(yīng)的最佳條件,Taq DNA聚合酶的濃度為1.0-2.5U/100uL反應(yīng)液； dNTP的濃度為20-200umol/L; Mg2+濃度為0.5-2.5mmol/L； 引物濃度為0.2-1.0umol/L。,三 PCR技術(shù)的應(yīng)用,（一） 反轉(zhuǎn)錄PCR,（二） 錨定PCR,（三） 反向PCR,（四） 巢式PCR,設(shè)計一對外測引物和一對內(nèi)測引物 先用外測引物擴增含目的DNA的大片段 再用內(nèi)測引物以擴增的大片段為模板擴增目的DNA片段,（五） 實時定量PCR,在普通PCR 儀的基礎(chǔ)上再配備一個激發(fā)和檢測的裝置。通過PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，加入標準品，可以對待測樣品中的目標基因進行準確定量。該法具有高特異性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，在臨床檢測方面有廣泛的用途。,（1）TaqMan熒光探針,TaqMan熒光探