酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組

1、酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用,.蛋白質(zhì)組的概述 .酵母雙雜交系統(tǒng) .酵母雙雜交在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用,（1）.產(chǎn)生背景,基因組研究自從開展以來已經(jīng)取得了舉世矚目的成就。在過去幾年中, 已經(jīng)陸續(xù)完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結(jié)構(gòu)比較簡單的生物的基因組DNA的全序列分析。規(guī)模更為龐大的人類基因組計劃在2005年完成全部基因組DNA的序列分析。但是也隨之產(chǎn)生了新問題。 大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個問題。 不僅如此, 在細(xì)胞合成蛋白質(zhì)之后, 這些蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)歷翻譯后的加工修飾。 也就是說, 一個基因?qū)?yīng)的不是一種蛋白質(zhì)而可能是幾種甚至是數(shù)

2、十種。 包容了數(shù)千甚至數(shù)萬種蛋白質(zhì)的細(xì)胞是如何運轉(zhuǎn)的？或者說這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是怎樣工作、如何相互作用、相互協(xié)調(diào)的？這些問題遠不是基因組研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)應(yīng)運而生。,（2）蛋白組簡介,蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(Marc Wilkins)最先提出來的, 最早見諸于1995年7月“Electrophoresis”雜志上, 它是指一個有機體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。 當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是, 在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時, 進行蛋白質(zhì)組分析。 對蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個方面： 一方面, 通過二維凝

3、膠電泳得到正常生理條件下的機體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜, 相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測機體、組織或細(xì)胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。 一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。 二維參考圖譜建立的意義在于為進一步的分析工作提供基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)組分析的另一方面, 是比較分析在變化了的生理條件下蛋白質(zhì)所發(fā)生的變化。 如蛋白質(zhì)表達量的變化, 翻譯后修飾的變化, 或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上的定位的改變等。,(3)蛋白質(zhì)組學(xué)過程,2.酵母雙雜交系統(tǒng),2.1 雙雜交系統(tǒng)的原理 2.2 Sos恢復(fù)系統(tǒng) 2.3 優(yōu)點及局限,2.1 雙雜交系統(tǒng)原理,酵母雙雜交技術(shù)是1989年由Fields

4、等最先應(yīng)的。與其他技術(shù)相比，它省去了耗時耗力的蛋白表達純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡便、快捷與廉價的優(yōu)點迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。根據(jù)對文獻的統(tǒng)計，目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)的。,酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。主要結(jié)構(gòu)由含有DNA 結(jié)合域和DNA 轉(zhuǎn)錄激活域二類載體以及酵母報告株構(gòu)成。 將DNA BD 與已知的誘餌蛋白質(zhì)X 融合,構(gòu)建出BD - X質(zhì)粒載體;將AD 基因與cDNA 文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示) 融合,構(gòu)建出AD- Y質(zhì)粒載體。,以Fields等人

5、建立的酵母雜交系統(tǒng)為例,Fields 等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2 基因有關(guān)的2 個蛋白質(zhì)Snf1 和Snf2 為模型,將前者與GaL4 的DB 結(jié)構(gòu)域融合,另外一個與Ga14 的AD 結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。由DB和AD 形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait) 和“獵物”或靶蛋白。如果在Snf1 和Snf2 之間存在相互作用,那么分別位于這2個融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因(reporter gene) 。通過對報道基因表達產(chǎn)物

6、的檢測,反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的2 個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。在此基礎(chǔ)上Fields 等人采用編碼- 半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因,并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受GaL4 蛋白調(diào)控的GAL1 序列。這個改造過的LacZ 基因被整合到酵母染色體URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和GAL80 基因(GaL80 是GaL4 的負(fù)調(diào)控因子) 被缺失,從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。已經(jīng)知道在Snf1 和Snf2 之間存在相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1 和Snf2 融合表達載體的酵母細(xì)胞才有- 半乳糖苷酶活性,單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出- 半乳糖苷酶活性。,

7、酵母雙雜交系統(tǒng)的實驗基本過程,Sos恢復(fù)系統(tǒng),原理： 正常情況下，當(dāng)有生長信號刺激的時候，酵母的Ras鳥苷酸交換因子Cdc25會富集到細(xì)胞膜上；這時Cdc25 能夠促使Ras蛋白的GDP與GTP的交換，啟動下游的信號，促進酵母細(xì)胞的生長。在酵母溫度敏感缺陷株CDC25-2中，Cdc25 由于突變喪失了上述功能，使得此菌株只能在25攝氏度下生長，而在限制溫度37攝氏度無法生長。Sos 是哺乳動物細(xì)胞中的Ras 鳥苷酸交換因子，與酵母的Ras 鳥苷酸交換因子Cdc25 同源；研究發(fā)現(xiàn)人Sos 能夠替代酵母Cdc25，使酵母細(xì)胞存活和增殖。于是在酵母溫度敏感缺陷株Cdc25-2 中，當(dāng)人的Sos 與

8、膜定位信號（肉豆蔻酰化或法呢酯化信號）融合后，就會富集到細(xì)胞膜上，從而以不依賴配體的方式活化Ras 及生長信號，彌補Cdc25 的突變，使該菌株在37攝氏度可以生長。,2.3 優(yōu)點及局限,雙雜交系統(tǒng)的另一個構(gòu)成部分是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因( repeetergene) 的重組質(zhì)粒的細(xì)胞。目前，大多采用的是酵母細(xì)胞。其具有以下優(yōu)點:,(1) 檢測在真核活細(xì)胞內(nèi)進行,在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實情況。,(2) 作用信號是在融合基因表達后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。,(3) 檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的

9、或暫時的相互作用。,(4) 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA 文庫,能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。,(5) 通過mRNA 產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時,酵母表型,XGal 及HIS3 蛋白表達等檢測方法均很敏感。,酵母雙雜交系統(tǒng)在分析蛋白蛋白間相互作用具高效和快速性,但在實際應(yīng)用方面仍存在一些局限性 。,(1) 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)無法進行。 (2) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”。,3.酵母雙雜交在

10、蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用,隨著 人 類 基因組計劃的進行及各種模式生物基因組序列的產(chǎn)生，人們的研究重點也轉(zhuǎn)移到對基因的產(chǎn)物 蛋白質(zhì)的研究和分析上。蛋白質(zhì)功能的研究著重在于蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)的時空表達模式和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用.由于雙雜交系統(tǒng)簡便，敏感，高效的特點,使它非常適合基因組水平的大規(guī)模篩選。,1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能 酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段

11、的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。,2、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可以研究抗原和抗體之間的相互作用，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進行檢測。,3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。,4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein