第四章 核酸序列分析-1.ppt

1、第四章 DNA序列分析,2,1 如何查詢下列文獻(xiàn)：Wan, Y. and Lemaux, P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 1994 ,104: 3748.,回顧,2上次上機(jī)操作內(nèi)容簡要說明。,3,序列分析其實(shí)就是從已知蛋白質(zhì)、RNA、DNA序列作出生物學(xué)推論的過程。,4,主要內(nèi)容,4.1 引言 4.2 序列的一般分析 4.3 基因預(yù)測(cè)與鑒定 4.4 非編碼區(qū)分析與調(diào)控元件識(shí)別,4.1 引 言,6,一、DNA序列分析的意義,DNA

2、序列分析是生物信息學(xué)中的重要內(nèi)容之一,DNA是生物遺傳信息的最終決定者,DNA序列攜帶的遺傳信息具有極高的復(fù)雜性,DNA序列分析是揭示遺傳語言復(fù)雜性的基本過程,7,二、基因結(jié)構(gòu)與功能簡介,原核生物基因結(jié)構(gòu),1 長開放閱讀框 2 高基因密度 3 簡單的基因結(jié)構(gòu) 4 基因組中GC含量變化非常大,特點(diǎn)：,8,真核生物基因結(jié)構(gòu),特點(diǎn)：,1 基因組規(guī)模大 2 非編碼區(qū)序列占絕大部分（人類，97） 3 基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜 4 具有復(fù)雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式 5 具有豐富的可變剪接 6 有明顯的CpG島、密碼子使用具有偏好性,9,序列一般性分析 基因識(shí)別與鑒定 非編碼區(qū)分析及調(diào)控元件識(shí)別,四、DNA序列分析基本內(nèi)容,

3、4.2 DNA序列的一般分析,11,華北制藥集團(tuán)的談杰創(chuàng)建的一個(gè)非常有用的生物信息學(xué)資源網(wǎng)站。 http:/www.bio-,國外主要網(wǎng)站 http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py/ /Tools/index.html http:/www.ebi.ac.uk/,重要分析工具網(wǎng)站,12,各種生物信息學(xué)軟件,13,法國巴斯德研究所：http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms:revseq,14,NCBI網(wǎng)站：http:/www.ncbi.nlm.nih.

4、gov/guide/all/#tools,15,EBI網(wǎng)站：http:/www.ebi.ac.uk/,16,序列統(tǒng)計(jì)包括核酸序列基本指標(biāo)的計(jì)算：分子質(zhì)量、GC百分含量、融合溫度（Tm值，又稱退火溫度）、摩爾消光系數(shù)等?？赏ㄟ^一些常用軟件如JaMBW軟件包中的一個(gè)小工具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等進(jìn)行綜合計(jì)算。,Oligo Calculator , /JaMBW/,一、序列統(tǒng)計(jì),17,JaMBW是一個(gè)分子生物學(xué)軟件包，功能包括：序列格式轉(zhuǎn)換、求序列的補(bǔ)體序列與逆序列、將DNA序列翻譯成蛋白序列、序列分析、

5、 多序列比較、特征位點(diǎn)查找、3維分子結(jié)構(gòu)查看、PCR引物設(shè)計(jì)、緩沖液設(shè)計(jì)等功能，包含了分子生物學(xué)研究常用的一些操作。JaMBW是一個(gè)非常出色的工具軟件。,以JaMBW 的Oligo Calculator為例演示,18,19,20,計(jì)算結(jié)果：,21,序列轉(zhuǎn)換主要包括兩方面的工作： 1）序列格式轉(zhuǎn)換 2）互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換,序列轉(zhuǎn)換是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)研究中最常遇到的工作之一，因此，掌握序列轉(zhuǎn)換的常用方法是分子生物學(xué)家和生物信息學(xué)家的基本要求。,二、序列轉(zhuǎn)換,22,ReadSeq是目前最流行的格式處理軟件之一。是美國印第安那大學(xué)的Don Gilbert開發(fā)編制的。 支持23種序列格式的轉(zhuǎn)換

6、，幾乎囊括了目前所有的一級(jí)序列格式。,/molbio/readseq/,1 序列格式轉(zhuǎn)換,23,選擇輸出格式,24,EMBL格式,）序列標(biāo)準(zhǔn)格式 XX(不能少） YYYYYYYYYYYYYYY,2）序列長度少于18bp時(shí)一定要用標(biāo)準(zhǔn)格式,3）序列長度大于18bp時(shí)，“XX”可省去。,序列格式說明：,25,2 互補(bǔ)與反向序列格式轉(zhuǎn)換,RevSeq程序是一款專門將序列進(jìn)行反向和互補(bǔ)轉(zhuǎn)換的小工具。 個(gè)頭雖小，但很實(shí)用。它是著名的生物信息學(xué)軟件包EMBOSS的一個(gè)成員。,http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.

7、py?form=revseq,26,粘貼序列,上傳序列文件,1）反向鏈 2）互補(bǔ)鏈 3）反向互補(bǔ)鏈,改變文件名,27,要求填寫E-mail地址,28,填寫驗(yàn)證碼,29,互補(bǔ)反向鏈,輸出轉(zhuǎn)換結(jié)果,30,同時(shí)轉(zhuǎn)換多條序列,31,三、序列翻譯,所謂序列翻譯，是指用計(jì)算機(jī)程序把核酸序列按三聯(lián)體密碼規(guī)則翻譯成蛋白質(zhì)序列。,6框架翻譯，即從正向1，2，3位堿基開始按三聯(lián)體密碼規(guī)則翻譯成3條蛋白質(zhì)序列以及從反向1，2，3位堿基開始翻譯得到3條蛋白質(zhì)序列，共6條蛋白質(zhì)序列。,問題： 究競(jìng)蛋白質(zhì)序列是不是真正表達(dá)的蛋白產(chǎn)物？,方法： 1）對(duì)于已知蛋白，可進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索判斷序列的可靠性。 2）對(duì)于未知新基因，則需

8、要參考序列的其他特定信息。,32,33,許多程序?qū)NA序列一次進(jìn)行全部6個(gè)閱讀框的翻譯。,程序之一：EBI著名軟件包EMBOSS中的Transeq http:/www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/ 特點(diǎn)： 1）輸入序列可以是原始序列，也可以是GCG，F(xiàn)asta，EMBL，GenBank，PIR等格式。 2）可一次翻譯成1條，同向3條，雙向6條蛋白質(zhì)序列。 3）翻譯時(shí)可選擇標(biāo)準(zhǔn)密碼子或其他類型的密碼子,34,Transeq主頁,35,翻譯結(jié)果（6框架）,36,程序之二： ExPASy的Translate Tool /tools/dna

9、.html 特點(diǎn)： 1）程序簡單，沒有太多的可選項(xiàng)，運(yùn)行速度快。 2）一次翻譯雙向6條蛋白質(zhì)序列。 3）輸出結(jié)果較Transeq清楚，不僅將終止密碼子用Stop英文單詞表示，還將起始密碼子以MET標(biāo)記出來,37,Translate Tool主頁,38,Translate Tool翻譯結(jié)果,39,程序之三： NCBI的ORF finder /gorf/gorf.html 特點(diǎn)： 1）輸入序列只能是Fasta格式。 2）輸出結(jié)果以圖形化表示，并將核酸序列與氨基酸序列同時(shí)排列出來。 3）可將結(jié)果直接用Blast進(jìn)行序列數(shù)據(jù)庫搜索比對(duì)。,40,ORF

10、 Finder主頁,41,ORF Finder 翻譯結(jié)果,No response,42,43,四、序列的限制性酶切分析,44,5AAGCTT3 3TTCGAA5,HindIII切割位點(diǎn),Ehel切割位點(diǎn),5GGCGCC3 3CCGCGG5,粘性末端,平末端,45,限制性內(nèi)切酶數(shù)據(jù)庫REBASE查詢,46,47,限制性內(nèi)切酶分析軟件： NEBcutter 該程序是與REBASE整合在一起的免費(fèi)限制性內(nèi)切酶分析軟件,特點(diǎn) 1）既可對(duì)我們自已的序列進(jìn)行分析，也可對(duì)GenBank中的序列進(jìn)行分析。 2）分析長度不能超過300kbase。 3)限制性內(nèi)切酶種類最齊全，提供NEB數(shù)據(jù)庫中的內(nèi)切酶和商業(yè)內(nèi)切

11、酶的酶切結(jié)果。 4）結(jié)果圖形化顯示，具有非常友好的交互性。,48,REBASE 主頁,REBASE工具選項(xiàng),49,NEBcutter工具,50,NEBcutter工具主頁,結(jié)果可保存2天,51,線性表示的酶切結(jié)果,52,環(huán)形表示的酶切結(jié)果,53,五、載體繪制,不論是在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)還是撰寫論文中，載體繪制是一項(xiàng)經(jīng)常遇到的工作。,載體（vector）是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。,54,作為載體應(yīng)滿足以下幾方面的要求：,(1)有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)； (2)外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體對(duì)受體細(xì)胞無害，

12、能接納盡可能長的外源DNA片段； (3)具有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出； (4)具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。,55,載體分類,按生物屬性分：非病毒類和病毒類,按功能分：克隆載體和表達(dá)載體,按進(jìn)入細(xì)胞類型分：原核載體、真核載體和 穿梭載體（shuttle vector）,56,各種基于本地機(jī)和Web在線設(shè)計(jì)的載體作圖軟件都比較多。,基于PC本地機(jī)的軟件：pDRAW32,Winplas，Sim Vector等。 基于Web 在線設(shè)計(jì)的軟件：Savvy（Scalable Vector Graphics Plasmid Map） http

13、://savvy/,57,58,59,60,本地機(jī)安裝軟件Winplas2.7,本程序無須安裝，直接打開使用。 載體元件分三類：ARC、 Marker、 Text,61,七、引物設(shè)計(jì),在基因克隆、核酸分子雜交、DNA序列測(cè)定和PCR等實(shí)驗(yàn)中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物。而實(shí)驗(yàn)的成敗與探針或引物的設(shè)計(jì)密切相關(guān)。,62,一個(gè)優(yōu)化的寡核苷酸引物在設(shè)計(jì)過程中應(yīng)考慮的幾個(gè)基本問題：,1）引物的3末端不互補(bǔ) 避免形成引物二聚體,2）引物分子內(nèi)不互補(bǔ) 避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),3）引物的組分和解鏈溫度 理想的引物應(yīng)當(dāng)有50的GC含量，40-60% 均能滿足PCR的擴(kuò)

14、增要求。,63,5）引物內(nèi)部穩(wěn)定性 在DNA測(cè)序和PCR中最好用5末端穩(wěn)定（GC含量高一些)，而3 末端不太穩(wěn)定（AT含量高一些）的引物。,6）引物的特異性 為獲得最終單一的PCR產(chǎn)物片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一和特異的，即在模板中沒有重復(fù)序列。,4）引物長度 產(chǎn)物長度等于或小于500bp,引物長度可短一些16-18bp；若產(chǎn)物大于5kb，可選用24個(gè)堿基的引物。,64,1）Oligo 6 Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設(shè)計(jì)軟件。（也需要注冊(cè)）,本地機(jī)引物設(shè)計(jì)程序,2）primer-premier 5.0 ,由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件。（現(xiàn)在已有破解的注冊(cè)機(jī)產(chǎn)生序列號(hào)，可以直接使用）,65,Web在線引物設(shè)計(jì)程序,通用引物在線設(shè)計(jì)程序：Primer3 是由Whitehea