cas9技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程

1、Cas9技術(shù)介導(dǎo)單基因細(xì)胞系敲除的實(shí)驗(yàn)流程一、CRISPR/cas9技術(shù)簡(jiǎn)介及原理 2013 年 1 月份，美國(guó)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室在Science雜志發(fā)表了基于 CRISPR-Cas 技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該技術(shù)與以往的技術(shù)不同，是利用靶點(diǎn)特異性的 RNA 將 Cas9 核酸酶帶到基因組上的具體靶點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割導(dǎo)致突變。 CRISPR/Cas9是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。 CRISPR 是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來(lái)的獲得性免疫防御機(jī)制。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基

2、配對(duì)與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA達(dá)到對(duì)基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)π∈蠛痛笫蠡蚪M特定基因位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯， 目前已經(jīng)成功應(yīng)用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。 通過(guò)基因工程手段對(duì)crRNA和tracrRNA進(jìn)行改造，將其連接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)得到了簡(jiǎn)化更方便研究者使用。通過(guò)將表達(dá)sgRNA的原件與表達(dá)Cas9的原件相連接，得

3、到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作二、Cas9技術(shù)介導(dǎo)單基因細(xì)胞系敲除的實(shí)驗(yàn)流程1、 設(shè)計(jì)識(shí)別靶位點(diǎn)的一對(duì)DNA Oligos 選擇PAM（NGG）5端的一段堿基序列20nt作為原間隔序列，即敲除的靶位點(diǎn)。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原間隔序列臨近基序。一般形式為NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質(zhì)粒的DNA 序列中) 原則： 選擇的序列必須在全基因組中進(jìn)行比對(duì)，原間隔序列必須唯一，否則會(huì)對(duì)其他基因進(jìn)行敲除而出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 優(yōu)先選擇DSB位點(diǎn)的側(cè)翼存在重復(fù)序列（如果DSB 的側(cè)翼存在重復(fù)序列，在進(jìn)行非同源末端

4、重組時(shí)能夠精確的介導(dǎo)斷裂位點(diǎn)堿基的缺失）。 PAM的5端盡量存在酶切位點(diǎn)。（有利于后期的活性檢測(cè)） 確定待敲除位點(diǎn)后，選擇23-至250bp的外顯子序列輸入到在線免費(fèi)設(shè)計(jì)sgRNA的軟件Input框中，然后進(jìn)行設(shè)計(jì)運(yùn)算，軟件會(huì)自動(dòng)輸出sgRNA序列。利用在線軟件可以選擇脫靶機(jī)會(huì)小的序列作為sgRNA模板序列。根據(jù)選擇的sgRNA模板序列，合成一對(duì)序列互補(bǔ)的DNA Oligos（同時(shí)設(shè)計(jì)檢測(cè)目的基因的引物一起合成）。 2、 構(gòu)建可表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒 將合成的Oligos以逐步降溫的方法退火成雙鏈，然后與公司提供的質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，再進(jìn)行涂板。次日在LB瓊脂平板上，挑取單

5、克隆6個(gè)，溶于20ul LB液中，渦旋后，將部分菌液接種到LB液中，37oC下250 rpm生長(zhǎng)，另部分的菌液用作模板進(jìn)行快速PCR，經(jīng)電泳確定陽(yáng)性克隆后，將相對(duì)應(yīng)的細(xì)菌送商業(yè)公司測(cè)序，同時(shí)將部分菌液接種到LB液體，37oC下250 rpm培養(yǎng)過(guò)夜?？偨Y(jié)：退火-連接-涂板-挑取單克隆-鑒定-測(cè)序3、sgRNA活性檢測(cè)3.1 sgRNA活性預(yù)檢測(cè)-SSA活性檢測(cè) SSA檢測(cè)：根據(jù)要求檢測(cè)sgRNA的活性及敲除效率，也可以選購(gòu)公司Precut pSG-target Cloning kit自行構(gòu)建報(bào)告載體用于檢測(cè)，公司一般提供陽(yáng)性及陰性sgRNA及其SSA report target質(zhì)粒。檢測(cè)原理：

6、一個(gè)終止子插入luciferase（GFP）的編碼區(qū)中央，luciferase（GFP） 就會(huì)失去活性。為檢測(cè)Cas9/sgRNA剪切活性，將一個(gè)Cas9/sgRNA的靶 點(diǎn)位置序列插在終止子后。在Cas9/ sgRNA的作用下，靶點(diǎn)位置產(chǎn)生 DSB，細(xì)胞通過(guò)同源重組方式修復(fù)DNA，形成一個(gè)有活性的luciferase。 通過(guò)與對(duì)照組的比值變化就可反應(yīng)Cas9/sgRNA剪切的活性水平。3.2 CRISPR剪切活性檢測(cè)-surveyor法 surveyor法即錯(cuò)配酶法：靶序列經(jīng)CAS/sgRNA切割后由于缺乏修復(fù)模板，將主要以非同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，或多或少會(huì)插入或刪除一些堿基。因此將靶序列

7、PCR擴(kuò)增后經(jīng)變性、退火，將形成錯(cuò)配。錯(cuò)配酶（主要是CEL1或T7E1酶）將識(shí)別錯(cuò)配的雜合雙鏈并剪切。產(chǎn)物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。3.3限制性內(nèi)切酶法 當(dāng)Cas9/sgRNA靶點(diǎn)位置中間序列存在限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)時(shí)，如果 通過(guò)Cas9/sgRNA發(fā)生突變，這個(gè)位點(diǎn)將可能被破壞，而不能被內(nèi)切酶酶切?？刹捎秒娪镜姆椒ü烙?jì)突變效率，以突變效率的高低來(lái)衡量 sgRNA的活性。 3.4非配對(duì)內(nèi)切酶法 T7 核酸內(nèi)切酶I（T7 endonuclease I，T7E1） 能夠識(shí)別不完全配對(duì)DNA 并對(duì)其進(jìn)行切割，如果通過(guò)Cas9/sgRNA發(fā)生突變，將基因

8、組 DNA 做PCR，將相對(duì)應(yīng)的PCR 產(chǎn)物與野生型DNA的PCR 產(chǎn)物等量混合， 并退火雜交，將產(chǎn)生非配對(duì)DNA 片段，將能被非配對(duì)內(nèi)切酶T7E1 剪切。 用電泳的方法估計(jì)突變效率，以突變效率的高低來(lái)衡量sgRNA 的活性。4、利用Cas9質(zhì)粒建立knock-out細(xì)胞系 將Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如果細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染困難，可采用電轉(zhuǎn)。通過(guò)熒光標(biāo)記觀察轉(zhuǎn)染效率，或者當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，采用有限稀釋法，接種96孔板。根據(jù)前述突變率決定克隆接種數(shù)量，由于Indel突變是隨機(jī)突變。因此，其中的2/3應(yīng)該是移碼突變。如突變率=30%，則建議接種克隆數(shù)為96個(gè)，最終約有5個(gè)陽(yáng)性克隆。 在熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況，選擇帶有熒光的克隆，適時(shí)進(jìn)行胰酶消化后，提取部分細(xì)胞的基因組DNA用作PCR模板。然后以前述引物和PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物先進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，如果出現(xiàn)條帶，則將PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序。待測(cè)序結(jié)果返回后，人工閱讀測(cè)序色譜圖?？纱_定基因是否突變以及突變基因的基因型。將攜帶有雙突變等位基因的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，保存，穩(wěn)轉(zhuǎn)系建立成功。CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)