實驗三蟾蜍坐骨神.ppt

1、廈門大學醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心 機能學模塊,蟾蜍坐骨神經(jīng)干復合動作電位特性Properties of Compound Action Potentials on Toad Sciatic Nerve Trunk,Introduction,1786年Galvani所做的雙金屬電極刺激蛙神經(jīng)引起下肢收縮的實驗 Galvani（17371798）意大利解剖醫(yī)學家及物理學家,檢流計，1848年德國人發(fā)明,1850年，用檢流計測得蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位的傳導速度為2030m/s,electrode,1933年美國科學家 Gasser和 Erlanger用示波器對外周神經(jīng)活動進行研究性總結(jié)，并發(fā)表了

2、著名的論文Electric signals of Nervous Activity（1939年）,用示波器做蛙坐骨神骨干動作電位實驗,陰極射線示波器，1922年美國人發(fā)明,細胞外記錄（ Extracellular Recording）實驗階段,劍橋大學Hodgkin和Huxley應(yīng)用金屬微電極 對烏賊巨神經(jīng)纖維電活動進行系統(tǒng)研究， Hodgkin和 Katz提出離子假說 1949年，凌寧和Gerard 發(fā)明玻璃微電極。電壓鉗和膜片鉗將電生理研究推向分子水平,用玻璃微電極做細胞電生理實驗,尖端直徑0.5m的玻璃微電極,細胞內(nèi)記錄（ intracellular Recording）實驗階段,目的（

3、objective）： 測定蟾蜍坐骨神經(jīng)干復合動作電位（compound action potential，CAP），研究蟾蜍坐骨神經(jīng)干的 特性、雙相動作電位形成機制及神經(jīng)損傷、藥物對神 經(jīng)興奮傳導的影響,1.材料和方法 (Materials and methods ),1.1實驗動物（laboratory animal) 蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，Zhuoshan Toad）,雄性蟾蜍皮膚光滑，前肢趾上有黑色婚墊，會鳴叫。雌性蟾蜍皮膚粗 糙，無婚墊，不會鳴叫,1.材料和方法 (Materials and methods ),1.2藥品(drug) 任氏液、2%普魯卡因、3Mol 氯化鉀,任氏液

4、由無機鹽和蒸餾水配置而成，每升溶液含NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl2 0.12g,、NaHCO3 0.20g、NaH2PO4 0.01g。任氏液的理化特性與蛙的組織液近似?？捎糜谕艿慕M織、器官潤濕和營養(yǎng)。,普魯卡因：局部麻醉藥，用于浸潤麻醉、傳導麻醉等。普魯卡因與Na+通道內(nèi)側(cè)受體結(jié)合，使通道蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，促使Na+通道失活狀態(tài)閘門關(guān)閉,1. 3器材( Experimental apparatus) RM6240生物信號處理系統(tǒng)(RM6240 biolgical signal collecting system )（成都儀器廠）、神經(jīng)標本盒（ nerve chamber )

5、。,RM6240C微機生物信號處理系統(tǒng),RM6240微機生物信號處理系統(tǒng)可以同時采集、放大、顯示、記錄、分析四路生物信號及一路刺激輸出，12導聯(lián)心電圖輸入記錄，可用于人體和動物實驗。儀器參數(shù)全程控設(shè)置，有多種數(shù)據(jù)分析功能和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換輸出功能。,神經(jīng)干標本盒。,S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+,S+、S-刺激電極，E接地電極，r1- 、r1+和r2- 、r2+引導電極，,1.4制備坐骨神經(jīng)干（ preparation of sciatic nerve trunk ）,蟾蜍毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中。,蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；標本腹面向上，用玻璃分針分

6、 離脊柱兩側(cè)神經(jīng)叢，用線在近脊柱處結(jié)扎，剪斷神經(jīng)；將神經(jīng)干從腹面移 向背面。標本背面向上固定，從大腿至跟腱分離坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)標本 置任氏液中備用,1.5 儀器連接和參數(shù) (Apparatus junction and parameter) 神經(jīng)干標本盒兩對引導電極分別接微機生物信號處理系統(tǒng)1、2通道。 儀器參數(shù)：1、2通道時間常數(shù)0.02s、濾波頻率1KHz、靈敏度5mV，采樣頻率：100KHz，掃描速度：0.2ms/div。單刺激方式，刺激幅度1.0V，刺激波寬0.1ms，延遲2ms，同步觸發(fā),RM6240C微機生物信號處理系統(tǒng),神經(jīng)干標本盒,S+ S- E R1 - R1+ R2- R

7、2+,采樣頻率,通道模式,掃描速度,靈敏度,濾波頻率,時間常數(shù),1.6 記錄動作電位( Record action potential) 神經(jīng)干標本置于標本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好，調(diào)節(jié)刺激電壓，記錄動作電位,神經(jīng)干標本,2.1 測定中樞端引導的雙相動作電位 （biphasic action potential, BAP) 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波刺激神經(jīng)干末梢端， 測定中樞端BAP正、負向振幅(amplitude，A)和 時程(duration，D）,2. 觀察（observations),Ac1,Dc1,Ac2,Dc2,2.2 測定末梢端引導的雙相動作電位 用1.0V

8、電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端， 測定末梢端BAP正、負相振幅和時程,Dp1,Dp2,Ap1,Ap2,Ap1,Ap2,2.3興奮傳導速度的測定 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1和第2對引導電極引導CAP起點的時間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計算出AP的傳導速度,S R1- R2-,t,2.4 引導電極間距離與動作電位振幅和時程的關(guān)系 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1對 引導電極間距為10、20、30mm時的BAP正相振幅和時程,A110,D110,A210,D210,要求：分別測量第1對引導電

9、極記錄的動作電位正相、負相的幅度和時程,Am,Dm,條件：刺激電壓1V, 刺激波寬0.1ms,2.5 測定單相動作電位（monophasic action potential，MAP） 用鑷子夾傷對1對引導電極間的神經(jīng)干，然后用1.0V電壓，波寬 0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端MAP振幅和時程,Dm,Am,Am,Dm,2.6 觀察刺激強度（U）與動作電位振幅的關(guān)系 刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長0.05V增加，刺激 電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅,圖 刺激強度與動作電位振幅的關(guān)系,Maximal stimulus,Thresh

10、old stimulus,要求：測定閾強度和最大刺激強度，刺激強度與動作電位振幅的關(guān)系曲線,神經(jīng)干引導所獲得復合動作電位（ compound action potential (CAP）與單神經(jīng)纖維引導的動作電位的性質(zhì)有所不同。,2.7 測定KCl處理前后MAP振幅 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，記錄3mol/LKCl 處理前，處 理后5時MAP的振幅,KCl 處理前后動作電位,Aap,KCl濾紙,2.8 測定 procaine 處理前后BAP振幅 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，記錄4procaine處理前， 處理后5時BAP的振幅。,procaine 處理前后動作電位,pro

11、cainel濾紙,蟾蜍坐骨神經(jīng)干電生理實驗,摘要（abstract） 目的:研究蟾蜍坐骨神經(jīng)干的生理特性及神經(jīng)損傷、藥物對神經(jīng)興奮傳導的影響。方法 應(yīng)用微機生物信號采集處理系統(tǒng)測定蟾蜍坐骨神經(jīng)干復合動作電位 結(jié)果:刺激電壓1.2V，刺激波寬0.1ms時，中樞端引導的動作電位正相和負相振幅分別為Ac1s mV和Ac2s mV， Ac1 大于Ac2 ，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；動作電位正相時程 Dc1s ms顯著短于負相時程Dc2s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)，末梢端引導的動作電位正相振幅Ap1s mV大于負相振幅Ap2s mV， 兩者有（或無）顯著性差異（p0.0

12、5)；動作電位,正相時程 Dp1s ms顯著短于負相時程Dp2s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；刺激電壓1.2V，刺激波寬0.1ms，引導電極等于10mm、20mm和30mm時，末梢端引導的動作電位正相振幅分別A110為7.85 2.11 mV、 A120為10.08 2.26 mV、 A130為10.60 2.52 mV， 、A120 、 A130大于A110 ，有高度顯著性差異（ p0.05).結(jié)論 在一定范圍內(nèi)神經(jīng)干動作電位振幅與刺激強度呈正相關(guān)，神經(jīng)損傷、3mol KCl、procaine 阻斷神經(jīng)的興奮傳導，興奮可在神經(jīng)纖維上雙向傳導， 引導電極間距小于動作電位波長時

13、，正相波和負相波疊加形成雙相動作電位,1. Materials and methods (材料和方法),1.1實驗動物（laboratory animal) 蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，Zhuoshan Toad） 1.2藥品(drug) 任氏液、2%普魯卡因、3Mol 氯化鉀。 1.3器材 (Experimental apparatus ) RM6240生物信號處理系統(tǒng)(RM6240 biolgical signal collecting system )（成都儀器廠）、神經(jīng)標本盒（ nerve chamber )。 1.4制備坐骨神經(jīng)干（ preparation of sciatic nerv

14、e trunk ）蟾蜍毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中。蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；標本腹面向上，用玻璃分針分離脊柱兩側(cè)神經(jīng)叢，用線在近脊柱處結(jié)扎，剪斷神經(jīng)；將神經(jīng)干從腹面移向背面。標本背面向上固定，從大腿至跟腱分離坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)標本置任氏液中備用。,1.5 儀器連接和參數(shù) (Apparatus junction and parameter) 神經(jīng)干標本盒兩對引導電極分別接微機生物信號處理系統(tǒng)1、2通道。 儀器參數(shù)：1、2通道時間常數(shù)0.02s、濾波頻率1KHz、靈敏度5mV，采樣頻率：40KHz，掃描速度：0.5ms/div。單刺激激方式，刺激幅度1.2V，刺激波寬

15、0.1ms，延遲5ms，同步觸發(fā) 1.6 記錄動作電位( Record action potential)神經(jīng)干標本置于標本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好，調(diào)節(jié)刺激電壓，記錄動作電位,2. 觀察項目（observations),2.1 測定中樞端引導的雙相動作電位（biphasic action potential, BAP) 用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干末梢端，觀察中樞端BAP正、負向振幅(amplitude，A)和時程(duration，D） 2.2 測定末梢端引導的雙相動作電位 用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端BAP正、負相振

16、幅和時程。 2.3 興奮傳導速度的測定 用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1和第2對引導電極引導CAP起點的時間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計算出AP的傳導速度。 2.4 引導電極間距離與動作電位振幅和時程的關(guān)系 用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1對引導電極間距為10、20、30mm時的BAP正相振幅和時程。,2.5 測定單相動作電位（monophasic action potential，MAP） 用鑷子夾傷對1對引導電極間的神經(jīng)干，然后用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端MAP

17、振幅和時程。 2.6 觀察刺激強度（U）與動作電位振幅的關(guān)系 刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長0.05V增加，刺激電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅。 2.7 測定KCl和procaine處理前后MAP振幅 刺激電壓1.2V，刺激波寬0.1ms，記錄 3 mol/L KCl、 procaine處理前，處理后5時MAP的振幅。,3.1 刺激波寬0.1ms時，閾刺激Uth為0.450.08V；最大刺激Umaxs V，刺激電壓1.0V時，動作電位的傳導速度為 s （m/s)見表1。,表1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干閾刺激、最大刺激和傳導速度,3.結(jié)果 （results）

18、,3.2 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms時，中樞端引導的動作電位正相和負相振幅分別為Ac1s mV和Ac2s mV，Ac1 大于Ac2 ，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；動作電位正相時程Dc1s ms顯著短于負相時程Dc2s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)，末梢端引導的動作電位正相振幅Ap1s mV大于負相振幅Ap2s mV， 兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；動作電位正相時程Dp1s ms顯著短于負相時程Dp2s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)，見表1和圖1、圖2,3.3 刺激電壓1.0V時，單相動作電位振幅Ams mV大（小)于雙相動作電位正

19、相振幅Ap1s mV，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；單相動作時程Dms ms顯著長于雙相動作電位正相Dp1s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)，見圖1、圖2和表2,表2 中 樞端引導和末梢端引導的動作電位參數(shù),3.3 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms，引導電極等于10mm、20mm和30mm時，末梢端引導的動作電位正相振幅分別A110為7.85 2.11 mV、 A120為10.08 2.26 mV、 A130為10.60 2.52 mV， 、A120 、 A130大于A110 ，有高度顯著性差異（ p0.05),見表3,表3 引導電極間距離與動作電位振幅和時程的關(guān)系

20、,3.5在刺激電壓低于Uthreshold時，測不到動作電位；刺激電壓從Uthreshold增加至Umaximal，動作電位振幅呈曲線增長，刺激電壓高于Umaximal動作電位振幅不再增長，見圖3。,3.6 刺激電壓1.0V，3Mol KCl處理前，Af為？，處理后，Ab為？,4. 討論(discussion),4.4 在兩引導電極間夾傷神經(jīng)，神經(jīng)沖動傳導被阻斷，雙相動作電位負相波消失，形成一相正波，于此可見，雙相動作電位是神經(jīng)沖動先后通過兩個引導電極形成的，沖動通過第1個電極，形成動作電位的正相波，沖動通過第2個電極，形成動作電位的負相波。,4.1 刺激電壓從Uth增加至Umax，神經(jīng)干動作

21、電位振幅隨刺激電壓增加而增高。神經(jīng)干動作電位不具有“全或無”性質(zhì)。坐骨神經(jīng)干為不同類型的神經(jīng)纖維組成，各個類型纖維的興奮性水平不同1，在一個有限的范圍內(nèi)神經(jīng)干動作電位的大小與刺激的強度成比例2 。,4.2 蛙神經(jīng)沖動的傳導速度在20時約為每秒30米 3 ，本實驗所測得的蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位的傳導速度為.,4.3 刺激蟾蜍坐骨神經(jīng)干中樞端，可在其末梢端引導出動作電位，反之也然，由此可以證明離體蟾蜍坐骨神經(jīng)具有雙向傳導興奮的能力。,4.5 刺激神經(jīng)干中樞端在其末梢端引導所得BAP和刺激神經(jīng)干末梢端在其中樞端引導所得BAP，正相振幅均大于等于負相振幅，正相時程均小于負相時程，由此表明在蟾蜍坐骨神經(jīng)

22、干AP引導時，兩引導電極處神經(jīng)纖維的多寡不是形成BAP正相振幅大于負相振幅和正相時程小于負相時程的主要原因。 在兩引導電極間夾傷神經(jīng)，神經(jīng)沖動傳導被阻斷，雙相動作電位負相波消失，形成的單相動作電位時程顯著長于雙相動作電位正相時程，單相動作電位振幅大于或等于雙相動作電位正相振幅。即負相波的存在，使雙相動作電位正相波的時程和振幅減小。移動正引導電極，增加兩電極距離，在一定范圍內(nèi)雙相動作電位的正相波的振幅和時程均增大。由此可以推測，正相波與負相波在時間軸上重疊，正相波和負相波疊加。 疊加發(fā)生在正相波去極后期，正相波波峰減小，時程縮短，當神經(jīng)沖動傳導被阻斷使負相波消失，正相波被疊加的部分顯示出來，正相波的波幅和時程均增大。疊加發(fā)生在正相波復極期，正相波波峰不減小，但時程縮短，當神經(jīng)沖動傳導被阻斷使負相波消失，正相波被疊加的復極化部分顯示出來，正相波時程延長。,雙相動作電位負相波的去極期完全與正相波疊加，其波幅減小程度大于正相波。負