液相色譜實(shí)用技術(shù)色譜柱的使用及保養(yǎng).ppt

1、液相色譜實(shí)用技術(shù),色譜柱的使用及保養(yǎng),良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣,拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效 保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件 定期檢測柱效 定期檢測儀器的譜帶展寬,色譜柱的使用及操作,流動相的轉(zhuǎn)換 特別是GPC柱 流速(壓力)的變化幅度 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱的保養(yǎng)（一）,樣品方面 除去微粒及雜質(zhì) 了解樣品在流動相中的溶解度 如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用,色譜柱的保養(yǎng)（二）,流動相方面 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)

2、 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質(zhì)含量 流動相對樣品的溶解度 有機(jī)溶劑或水的比例,在線的保護(hù)裝置,給色譜柱提供物理的保護(hù) 除去樣品及流動相中的顆粒 給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù) 防止分析柱被化學(xué)污染 裝置 在線過濾器 自裝填料保護(hù)柱 預(yù)裝保護(hù)柱,在線過濾器,In-Line Filter，部件號 WAT084560 防止顆粒在色譜柱頭累積 優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效 在需要高柱效的分析時(shí)中常用（如：氨基酸分析） 可更換的消耗品 更換濾芯，部件號 WAT005139 (5/pkgs) 更換墊圈，部件號 WAT084567 (10/pkgs),保護(hù)柱,可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響

3、到整個(gè)色譜柱的柱效，特別是在用微柱時(shí) 保護(hù)柱的種類 普通自裝填料的保護(hù)柱 Waters的部件號，WAT084550，用戶自裝填料 影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大 Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱 Waters的部件號，WAT088141 有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低,可換芯式保護(hù)柱,新型的保護(hù)柱 Sentry Guard,適應(yīng)的用戶類型 非常臟, 非常復(fù)雜的樣品本底 生化樣品, 溶液 環(huán)境樣品 食品 不想作太多的固相萃取 不想降低柱效,新型的保護(hù)柱 Sentry Guard,Sentry Guard 的特點(diǎn),特點(diǎn) 高質(zhì)量, 高效填料 - 不損失柱效 增加分

4、析柱效 - 增加適應(yīng)范圍 20mm柱長 - 臟樣品載荷能力大，能延長保護(hù)柱壽命 手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具 通用柱套 - 適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑) 整體式（對Waters柱）- 使用方便，容易 各種不同填料配合Waters柱,Sentry Guard 的規(guī)格,產(chǎn)品描述 3.920mm柱長 適應(yīng)任何色譜柱，不需工具即可安裝及更換 可換柱芯式設(shè)計(jì)，提供各種填料: BondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, Silica Nova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, Silica Resolve: C18, C8, Silica Delta

5、-Pak: C18, C4 Symmetry:C18, C8,色譜柱的清洗,對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗 硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質(zhì) 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗,色譜柱的存放,存放前的處理 除去雜質(zhì)、鹽 合適的存放溶劑 避免色譜柱床的干枯 避免機(jī)械震動 防止細(xì)菌生長 注意存放的溫度,色譜柱常見毛病,柱壓過高 多少才算高? 不同色譜柱有差異 不同系統(tǒng)有差異 不同溶劑有差異 柱效低 重復(fù)性差 不出峰，回收率低,柱壓過高,為什么柱壓會過高 微粒堵塞 樣品 流動

6、相 密封墊 柱床膨脹 不可逆吸附 細(xì)菌生長,柱效低,為什么柱效低 色譜柱被污染 過濾片部分堵塞 樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞 色譜柱內(nèi)的死體積 流動相pH值及組成不合適造成固定相流失 流速急劇變化造成固定相物理損壞 機(jī)械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫 柱床收縮或干枯,重復(fù)性差、回收率低,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差 色譜柱被污染 流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相過強(qiáng)或流動相過弱 非特異性吸附,色譜柱以外的因素（一）,“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！ 儀器問題：連接不好造成死體積 進(jìn)樣器 檢測器 管路，連接口 保護(hù)柱 在線過濾

7、器堵塞 流動相問題：色譜柱未平衡好 進(jìn)樣量太大,色譜柱與儀器的聯(lián)接,除HP外，不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時(shí)，會造成： 色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏 解決辦法： 自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭 使用“通用”型接頭（錐箍及螺母） 這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。,Waters色譜柱的聯(lián)接,Waters及Phase Separations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長度不同，其長度被稱為：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外

8、的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長度為0.130英寸 Spherisorb品牌的色譜柱及Phase Separations公司其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其 stop-depth 為0.090英寸,不同的Stop-Depth長度,色譜柱以外的因素（二）,柱壓過高問題，不一定是色譜柱問題！ 系統(tǒng)反壓問題 阻尼器堵塞 進(jìn)樣器堵塞 管路或連接口堵塞 在線過濾器不干凈 保護(hù)柱 壓力傳感器不準(zhǔn)確 流速是否錯(cuò)誤?,色譜柱以外的因素（三）,實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差 梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足 溫度波動 流動相組成改變 樣品溶劑不同 樣品穩(wěn)定性不好 方法的開發(fā)

9、不好 緩沖液的pH值不合適 緩沖液的緩沖能力不足,簡單的判別方法,高的柱反壓是否伴隨著 保留時(shí)間變化? 峰形變壞? 分辨率變壞? 測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬 典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于 100 微升 如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng),測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬,卸下色譜柱，用UNION代替之 按測柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約25微升 用5 sigma方法測4.4%峰高處的峰寬：W 儀器參數(shù) 流速1.0 ml/min 紙速20 cm/min (用記錄儀時(shí)，接檢測器10mV檔) 檢測器靈敏度0.5-1.0AUFS (用記錄儀時(shí)) 檢測器時(shí)間常數(shù)小于0.2 譜帶展寬（ml）=1000W（cm）/20（記錄儀

10、）=1000W（min） （工作站）,流動相及樣品的預(yù)處理,液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）,液相色譜對流動相的要求,除色譜柱對流動相對的要求外，還有 與檢測器匹配 脫氣 避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)） 溶劑的粘度 細(xì)菌的生長,流動相的脫氣,流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準(zhǔn)確 輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小 保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護(hù)色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化,流動相脫氣的方法,加熱 簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化 抽真空 同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果 超聲波

11、簡單，但效果不理想。 通惰性氣體（一般用氦氣） 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度 脫氣機(jī) 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,樣品的預(yù)處理,樣品預(yù)處理的目的 除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 濃縮微量的組份 提高檢測的靈敏度及選擇性 改善分離的效果 有利于色譜柱及儀器的保護(hù),樣品的預(yù)處理重要性,占樣品分析時(shí)間的比例 樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間 占分析的消耗總成本最大 消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié) 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟,樣品預(yù)處理常用的方法,高速離心 過濾、超濾 選擇性沉淀 衍生反應(yīng) 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak樣品處理小柱 其他,

12、樣品預(yù)處理的過程,去除微粒,過濾 過濾膜/過濾裝置 有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m) 膜片可更換 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便簡單，交叉污染小 有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理 高速離心 大于：10,000g,超濾,機(jī)理 超濾是一種基于分子量分離的技術(shù) 目的 根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份 除去小分子樣品中的大分子蛋白 脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白 有機(jī)溶劑 乙腈，甲醇 強(qiáng)酸 三氯乙酸，過氯酸 鹽 50% 硫酸銨 10% TCA,樣品衍生,提高檢測的靈敏度 增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測的靈敏度 增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測器 改變分離

13、的選擇性 改變組份的基團(tuán)，如： 變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離 典型的例子 氨基酸分析,樣品衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,濃縮樣品,濃縮樣品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色譜法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃?。⊿PE）技術(shù),固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份 固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性 實(shí)驗(yàn)室中6080%的成本及工作量在樣品制備上 加速樣品的制備時(shí)間 降低樣品前處理的成本 提高分析的準(zhǔn)確性及回收率 更容易自動化 減少樣品處理步驟 降低對不穩(wěn)定樣品的影響 提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters專門開發(fā)

14、了固相萃取技術(shù)（SPE） Sep-Pak小柱的應(yīng)用領(lǐng)域 除去雜質(zhì)及干擾組份 把樣品分成不同極性的組分析 富集微量的組份 Sep-Pak小柱的主要種類 反相 正相 離子交換,Sep-Pak的種類,根據(jù)Sep-Pak及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開 讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用 讓所感興趣的樣品通過小柱，雜質(zhì)留在柱上 讓雜質(zhì)留在柱上，所感興趣的樣品通過小柱,各種Sep-Pek小柱（一）,正相 包括Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina 可先用6到10倍柱體積的非極性（通常是樣品溶液）平衡 加入樣品 用非極性溶

15、劑洗脫不想要的組份 用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份 用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如NH2 / CN 確認(rèn)回收率,各種Sep-Pek小柱（二）,反相 包括C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN 可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍 柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了 樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中 加入樣品 用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份 用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份 用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份 確認(rèn)回收率,各種Sep-Pek小柱(三),離子交換 包括Acc

16、ell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2 可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡， 樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中 加入樣品 用弱緩沖液洗脫不想要的組份 用強(qiáng)一些緩沖液（改變pH或離子強(qiáng)度）洗脫第一組感興趣的組份 用更強(qiáng)的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份 確認(rèn)回收率,Sep-Pak小柱的方法開發(fā),SPE方法開發(fā)的幾個(gè)關(guān)鍵因素 文獻(xiàn)查閱 Waters有專門Sep-Pak應(yīng)用資料的數(shù)據(jù)庫（P/N = 88286） 查閱Waters的網(wǎng)頁（） 流速控制 同色譜理論：以10ml/min潤濕小柱，15ml/min加載樣品 離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品 以15ml/min流速洗脫樣品 注意樣品本底的不同 注意載荷量及加樣方式,用Sep-Pak C18除去雜質(zhì),使極性的雜質(zhì)先流出 中等極性樣品流出，保留并分析 小柱及其非極性雜質(zhì)丟棄 舉例：多肽混合物脫鹽 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把樣品載入小柱 鹽等極性物先流出。 用更強(qiáng)(極性更弱)的流動相洗出極性較弱的多肽,用Sep-Pak C18分組分析,樣品是一種叫作“Kool-Ai