免疫學(xué)技術(shù)和臨床.ppt

1、免疫學(xué)技術(shù)和臨床,美國貝克曼庫爾特公司 免疫產(chǎn)品市場部 洪軍 2007.4 安徽,內(nèi)容摘要,什么是免疫分析的表現(xiàn) 免疫分析的基本概念 如何去設(shè)計(jì)一個(gè)免疫分析試劑 免疫分析對(duì)臨床意義的改變 Access2 介紹,什么是免疫分析的表現(xiàn),免疫檢測(cè)的分析表現(xiàn),準(zhǔn)確性 精密度 靈敏度 特異性,檢測(cè)線性范圍 試劑穩(wěn)定性 定標(biāo)周期 開瓶效期,免疫分析檢測(cè)的臨床表現(xiàn),臨床靈敏度和特異性是分析結(jié)果準(zhǔn)確性的臨床表現(xiàn):,理想狀態(tài),健康人群,疾病人群,靈敏度 100% 特異性 60%,特異性 100% 靈敏度 50%,靈敏度增加 特異性增加,假陰性 假陽性 Cut-off,設(shè)置cutoff值在此處 用于篩查分析,設(shè)置

2、cutoff值在此處 減少錯(cuò)誤診斷帶來的高花費(fèi),設(shè)置cutoff值在此處 為了最少化錯(cuò)誤結(jié)果,關(guān)于分析試劑的檢測(cè)靈敏度的定義,分析及功能靈敏度 分析靈敏度(Analytical Sensitivity) 使用A點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品 分析內(nèi)的測(cè)試 最低可辨別0值的功能 分析試劑的理論上的極限 功能靈敏度(Functional Sensitivity) 一系列不同厚度的標(biāo)準(zhǔn)品 分析間的測(cè)試,用20%的CV值來分 用來描述分析的臨床表現(xiàn) 用人血清分析多于20天,且用多個(gè)試劑批號(hào)和儀器,分析表現(xiàn)特點(diǎn): 正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）,免疫分析的基本概念,免疫分析的經(jīng)典定義,免疫分析（Immunoassa

3、y） 是一種技術(shù)用于檢測(cè)和/或定量,通過一個(gè)特殊的只能和被分析物結(jié)合的抗體,免疫學(xué)測(cè)定的中心問題,作為免疫反應(yīng)，抗原抗體的選擇是整個(gè)免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關(guān)鍵 如何選擇好一個(gè)抗體去檢測(cè)一個(gè)被檢物質(zhì)，而不與非常相似結(jié)構(gòu)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)，或漏掉須反應(yīng)的物質(zhì)，這是分析設(shè)計(jì)的重中之重 抗體的量必須恰當(dāng)，過多會(huì)引起復(fù)合物的溶解,關(guān)于抗體的親合力,抗體除了要求純度外（單價(jià)特異性）還必須要求親合力，效價(jià)指抗體的量，親合力指抗體的質(zhì) 在非競爭免疫反應(yīng)的方式中抗體親和力比標(biāo)記物的最低檢測(cè)極限更能影響分析的靈敏度 在競爭法免疫反應(yīng)的方式中抗體親和力直接關(guān)系到競爭的結(jié)果 對(duì)于樣品中的干擾物質(zhì),親合力影響分析

4、的抗干擾的能力,免疫分析的工作定義,免疫分析(Immunoassay) 是一種測(cè)試方式,使用特殊的抗體與被檢測(cè)物質(zhì)的結(jié)合,此被檢測(cè)物質(zhì)不能通過簡單的化學(xué)方法所容易檢測(cè)到的. 通常在檢測(cè)系統(tǒng)中會(huì)使用到一種叫標(biāo)記物（labeling）的物質(zhì),常標(biāo)記在抗體上 通常會(huì)有一個(gè)分離（separation）的過程在最后讀取信號(hào)前 總是需要去仔細(xì)關(guān)注一下分析的方式（format）,Access 的技術(shù),免疫分析 - “what 檢測(cè)技術(shù) 化學(xué)發(fā)光 分離技術(shù) 磁性顆粒 分析方式 靈活,- “how,分析方式,檢測(cè)技術(shù),分離技術(shù),檢測(cè)技術(shù),免疫分析 檢測(cè)技術(shù)(Detection) 有許多可用的方法 應(yīng)用一些 “標(biāo)

5、記物 所產(chǎn)生的一些能量進(jìn)行測(cè)定 標(biāo)記物可以或可以不被激活而產(chǎn)生能量 通過一些相應(yīng)的檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記物產(chǎn)生的能量進(jìn)行測(cè)定 分離技術(shù) 分析方式,放射免疫分析(Radioimmunoassay),優(yōu)勢(shì) 優(yōu)秀的靈敏度 較寬的檢測(cè)線性范圍 局限性 標(biāo)記物的半衰期短 試劑效期短 檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性差 每次檢測(cè)都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線 分析的反應(yīng)時(shí)間長，半天2天 發(fā)射性污染有害 很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè),熒光,熒光素(Fluorophores) FIA，DELFIA 原理 熒光底物, 4-MUP，或熒光標(biāo)記物，鑭系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+ 吸收光為一個(gè)短波長的光，而發(fā)射光為一個(gè)長波長的光 通過熒光計(jì)檢測(cè) 優(yōu)勢(shì) 與RIA具

6、有相似的靈敏度和檢測(cè)線性范圍 避免了RIA對(duì)危害污染物處理的麻煩和半衰期短的問題 局限性 可能會(huì)有來自樣品中的一些自身熒光物質(zhì)或短壽命的熒光物質(zhì)的干擾 需用空白對(duì)照，速率法或推遲讀數(shù)來克服,酵-顏色的變化,酵(Enzymes) - EIA 原理 在免疫分析結(jié)束后通過催化所加入的酵底物 典型的催化反應(yīng)包括顏色的變化,用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè) 優(yōu)勢(shì) 非常容易使用的技術(shù)用于一些定性的分析 局限性 對(duì)定量分析所要求的靈敏度和寬線性難以實(shí)現(xiàn) ELISA技術(shù)必須每次定標(biāo) 試劑部分成分要復(fù)溶重組 反應(yīng)時(shí)間較長,化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光物質(zhì) - CLEIA 原理 不穩(wěn)定的分子通過加入一些化學(xué)基團(tuán)變得很穩(wěn)定, 而移去這些

7、起穩(wěn)定作用的化學(xué)基團(tuán)后,分子結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定發(fā)出光（pH的改變，酵切作用，電激發(fā)等） 優(yōu)勢(shì) 具備RIA所擁有的優(yōu)勢(shì)(靈敏度和寬線性),但排除其缺點(diǎn) 用一個(gè)簡單的光度計(jì)讀數(shù) 非常低的背景干擾 類型 閃爍(flash), 持續(xù)(glow) 發(fā)光 發(fā)光物質(zhì)的穩(wěn)定性 水溶液中的穩(wěn)定性,化學(xué)發(fā)光物質(zhì),AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)-最穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（第三代） 第一代：魯米那 第二代：丫啶酯類，三聯(lián) 啶釕 代表性分析系統(tǒng) 貝克曼庫爾特 - Access/Access 2 /DxI800 終點(diǎn)讀數(shù), 更穩(wěn)定,ACCESS化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn),很寬的檢測(cè)線性范圍 可檢測(cè)

8、到6個(gè)數(shù)量級(jí)(例如: 1 - 100,000 units) 極高的靈敏度 可檢測(cè)到小到10-21 摩爾/升 很底的背景干擾 對(duì)于一些超敏分析項(xiàng)目,有相當(dāng)接近零值的背景信號(hào) 更超強(qiáng)的試劑穩(wěn)定性 試劑效期 開瓶效期 定標(biāo)周期,分離技術(shù),免疫分析 檢測(cè)技術(shù) 分離技術(shù)(Separation) 有很多方式 典型的是,特異性結(jié)合的分析物被保留而未結(jié)合物質(zhì)和無用的反應(yīng)物被清除 分析方式,技術(shù)的創(chuàng)新,磁顆粒包被技術(shù),磁顆?？贵w包被技術(shù) 磁顆粒均勻的懸浮于整個(gè)反應(yīng)體系 分析物在磁顆粒表面捕獲 磁顆粒在磁場中被清洗 磁顆粒重新懸浮十分容易 優(yōu)勢(shì) 快速的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 較少的樣品量 提高檢測(cè)的靈敏度 極好的批內(nèi)重顯性

9、可以探針取放，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,分析方式,免疫分析 檢測(cè)技術(shù) 分離技術(shù) 分析方式- 有很多種方式 可定義為分析的 “處方 設(shè)置一個(gè)最優(yōu)化的方式(可變量)去最優(yōu)化項(xiàng)目的臨床應(yīng)用,分析方式,可變量 夾心法(Sandwich) vs.競爭法(competitive) 標(biāo)記物的放置 同步(Simultaneous) vs. 分步(sequential) 試劑/樣品加入的順序 孵育的次數(shù)(步驟) 清洗分離的次數(shù)(步驟) 試劑/樣品的體積/厚度 孵育的時(shí)間 孵育的溫度,Access 的分析方式,基本分析方式 夾心法(Sandwich) 競爭結(jié)合(Competitive binding) 試劑的加入，孵育和清洗

10、同步(Simultaneous) (1步, 1次清洗) 分步(Sequential) (2步, 2次清洗) “Piggyback (2步, 1次清洗),夾心法分析方式,捕捉抗體(Capture antibody)和標(biāo)記抗體(labeled antibody) 每個(gè)不同的抗體可以針對(duì)不同的抗原決定簇，或二個(gè)在同一個(gè)抗原決定簇 分析更特異因?yàn)槎€(gè)抗體同時(shí)反應(yīng) 適合于檢測(cè)大分子物質(zhì),bhCG TSHIgEProlactin FSH LH FerritinHBsAg,競爭法分析方式,只有捕捉抗體 主要針對(duì)小分子物質(zhì)檢測(cè) 沒有足夠表面積的分析物去符合 “夾心法 要求,T3FT3 B12 Digoxin

11、Progesterone T4 FT4 Folate Cortisol Estradiol,如何去設(shè)計(jì)一個(gè)免疫分析試劑,一個(gè)免疫分析項(xiàng)目的誕生,里程碑(Milestones) 市場調(diào)研確定需求 項(xiàng)目的詳細(xì)特點(diǎn)要求 確定分析方式 研發(fā)和優(yōu)化 證明分析表現(xiàn)符合項(xiàng)目的詳細(xì)特點(diǎn)要求 (beta sites, clinical studies) 提交注冊(cè),項(xiàng)目臨床應(yīng)用的要求,臨床應(yīng)用(claims) 篩查（Screening） 檢測(cè)（Detection） 診斷（Diagnosis） 分層（Staging） 預(yù)后（Prognosis） 監(jiān)測(cè)（Monitoring）,項(xiàng)目的臨床應(yīng)用與分析表現(xiàn),必須到達(dá)的分析

12、表現(xiàn)特徵 靈敏度（Sensitivity） 特異性（Specificity） 精密度（Precision） 線性范圍（Dynamic range） 其它,分析方式的選擇,需考慮的因素 分析物的特徵 體積（競爭法還是夾心法） 厚度（一步法，二步法，反應(yīng)時(shí)間等） 潛在的“鉤狀效應(yīng)（hook effect）- 假陰性 解決的方法可以使用2步法方式 樣品量和試劑量的平衡 抗干擾能力 儀器的能力局限性 預(yù)處理的要求,試劑原材料的選擇,原材料 抗體 標(biāo)準(zhǔn)品 封閉試劑（稀釋液） 清洗緩沖液,Y,Y,Y,Y,Y,抗體的選擇,單克隆(Monoclonal) 和多克隆( polyclonal) 選擇的標(biāo)準(zhǔn)(cri

13、teria) 特異性(Specificity) 靈敏度(Sensitivity) 供應(yīng)能力(Supply) 相關(guān)性(Correlation) 可制造性(Manufacturability) 花費(fèi)(Cost),多克隆抗體(Polyclonal Antibodies),免疫動(dòng)物獲得,如羊或兔 時(shí)間長,復(fù)雜的制作流程 注射,監(jiān)測(cè)滴度(可能反覆注射) 周期性的抽血獲得 特徵化(Characterization)和純化(purification) 生產(chǎn)出雞尾酒式的抗體,針對(duì)所有抗原決定簇 適合對(duì)臨床靈敏度要求較高分析測(cè)試,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,單克隆抗體(Monoc

14、lonal antibodies),克隆的結(jié)果 抗體的產(chǎn)生具有高度的同源性和特異性并針對(duì)一個(gè)抗原決定簇 可以選擇最好的抗體 在大量生產(chǎn)時(shí)可以確保持續(xù)的供應(yīng) 適合對(duì)臨床特異性和批間一致性要求較高的分析測(cè)試,抗體的選擇,篩選 抗體需經(jīng)過靈敏度，特異性和穩(wěn)定性的評(píng)價(jià) 許多的抗原決定簇并非一種分子所獨(dú)有 被測(cè)抗原的穩(wěn)定性不同 被測(cè)抗原的游離和結(jié)合方式,案例: hLH 抗原位點(diǎn)圖,Beta,Alpha,B-D 1 hTSH hCG,B-D 2 hCG,A-D 1 hCG hFSH hTSH,B-D 3,A-D 3,A-D 2 hCG hFSH hTSH,案例: Troponin-I 抗原位點(diǎn)圖,肌鈣蛋白

15、 - I 穩(wěn)定性的問題 氧化的問題 磷酸化的問題,N-terminal,C-terminal,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,P,O,O,_,_,Access 1st Gen,31-34,58-70 (cross-react),157-160,PMP,Detect,Access AccuTnI,_,_,24-40,41-49,PMP,Detect,抗體的選擇,等分子(Equimolar) vs. 非等分子(non-equimolar)分析 依賴于特異性抗體的選擇,結(jié)合方式 -一些位

16、點(diǎn)被隱藏,游離方式 -所有位點(diǎn)都暴露,PSA,ACT,PSA,嗜異性抗體(Heterophile Antibody),病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對(duì)動(dòng)物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊) 來源于暴露于這些動(dòng)物或接受過動(dòng)物血清的治療 分析的干擾 可以在雙單克隆夾心法分析方式中引起假陽性 可以在單克隆/多克隆分析方式中出現(xiàn)假陰性,嗜異性抗體反應(yīng),假陽性 較多見 嗜異性抗體在捕捉抗體和檢測(cè)抗體中搭橋,出現(xiàn)在雙單克隆夾心法方式中,嗜異性抗體反應(yīng),假陰性 較少見 嗜異性抗體爭奪捕捉或檢測(cè)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn),出現(xiàn)在單克隆/多克隆分析方式中,稀釋液,封閉劑（稀釋液）可以加在反應(yīng)基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi) 動(dòng)物蛋白

17、（鼠，兔，羊等） 各個(gè)廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會(huì)不同程度的受到任何一個(gè)病人血清的影響！,定標(biāo)程序,廠家產(chǎn)生的主定標(biāo)曲線 感覺節(jié)省的校正型 2 點(diǎn)定標(biāo) 會(huì)增加定標(biāo)的頻率 對(duì)非線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能會(huì)有問題(大多數(shù)的免疫分析產(chǎn)生的是非線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線) 多點(diǎn)定標(biāo)曲線 定量 典型的是6個(gè)水平, 定性 典型的是2個(gè)水平 可以達(dá)到最大的靈敏度,準(zhǔn)確性和精密度 可以有更長的定標(biāo)周期間隔,標(biāo)準(zhǔn)品 參比物,參比物 純化蛋白(Purified protein) 通常制作較便宜 相對(duì)較短的穩(wěn)定時(shí)間,需特殊的存放條件 一般需要凍干存貯 可能會(huì)有批間的不一致性 重組(Recombinant) 相對(duì)昂貴 很長的研發(fā)時(shí)間 更

18、穩(wěn)定和可靠 可以以液體的方式供應(yīng),分析清洗液,清洗液使用的類型和量，在清洗步驟結(jié)束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗殘留的有效去除能力等，都會(huì)影響到分析表現(xiàn) 清洗液中加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┛梢匀コ恍枰纳锘钚晕镔|(zhì) (干擾物質(zhì)),免疫反應(yīng)中不能用水進(jìn)行分析內(nèi)的清洗分離!,試劑的優(yōu)化,需優(yōu)化參數(shù) 時(shí)間 程序步驟 各類試劑厚度 pH/離子強(qiáng)度 需優(yōu)化的內(nèi)容 擴(kuò)散的速率 結(jié)合的速率 復(fù)合物的穩(wěn)定性,優(yōu)化后達(dá)到的表現(xiàn) 靈敏度(Sensitivity) 精密度(Precision) 線性范圍(Dynamic range) 準(zhǔn)確性(Accuracy) 相關(guān)性(Correlation),試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果的影響,臨床試驗(yàn)結(jié)果反映了試驗(yàn)過程中各種條件的優(yōu)化,免疫分析設(shè)計(jì)及優(yōu)化,開發(fā)免疫分析試劑盒的過程就是選擇并優(yōu)化各種實(shí)驗(yàn)條件，達(dá)到預(yù)期結(jié)果并能準(zhǔn)確反應(yīng)臨床真實(shí)情況的過程,抗原/抗體,分析方式,分離技術(shù),檢測(cè)技術(shù),總體分析表現(xiàn),Beckman Access AccuTn-I,符合NABC/IFCC/ESC/ACC的導(dǎo)則要求 最好的99%分位值的比值 沒有嗜異性抗