抗生素敏感實驗

1、第三十四章抗微生物藥物和敏感性試驗陳文昭,第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物,抗菌藥物（antibacterial agents）:具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物。 抗生素：細菌、真菌、放線菌等的代謝產物化學合成藥物：經化學改造的半合成抗生素和化學合成藥物,抗菌藥物： 對病原微生物具有較高的 “選擇性毒性作用” 對患者不造成損害,抗菌藥物的作用機制,a.干擾細菌細胞壁的合成 b.損傷細菌細胞膜 c.影響細菌蛋白質的合成 d.抑制細菌核酸的合成 e.抑制細菌葉酸的代謝 f.抑制結核環(huán)脂酸的合成,一、青霉素類抗生素,天然青霉素：青霉素G 青霉素V 不產青霉素酶的G+球菌和G-球菌 耐青霉素酶青霉素

2、：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 產青霉素酶的G+菌和G-球菌,氨基組青霉素：氨芐西林 阿莫西林等 青霉素G敏感的細菌，大部分大腸、奇變、流感等G-菌。 羧基組青霉素：替卡西林 羧芐西林等 氨芐西林無效的G-菌，產-內酰胺酶的腸桿菌和假單胞菌有作用 脲基組青霉素：美洛西林 阿洛西林 派拉西林等 75克雷伯菌、銅綠假單胞菌有抑制作用，腸桿菌、厭氧菌有好作用、對腸球菌和鏈球菌強于羧基組,廣譜青霉素：,作用機制,青霉素類抗生素作用于細胞壁合成后階段的酶 阻斷肽聚糖合成的最后階段肽聚糖鏈的組裝和三維結構的構建。 該階段由下面幾種酶催化完成： 轉糖基酶、轉肽酶、D-羧肽酶、內肽酶 不同-內酰胺類

3、抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用,二、頭孢菌素類抗生素,第一代頭孢菌素：頭孢噻吩、頭孢唑啉等 對G+菌有較強作用 第二代頭孢菌素：頭孢呋辛、頭孢克洛等 對產-內酰胺酶的G-桿菌有作用 第三代頭孢菌素：頭孢噻肟、頭孢他啶等 對產-內酰胺酶的G-桿菌有較強的作用 第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅等 對腸桿菌科細菌和銅綠假單孢菌作用強,作用機制,頭孢菌素類抗生素和青霉素結合蛋白結合,抑制細菌細胞壁合成。PBP位于質膜，不同的頭孢菌素與不同的PBP結合，發(fā)生不同的效應，使菌形成絲狀體或球體，最終溶解死亡。,三、其他-內酰胺類抗生素,單環(huán)-內酰胺類抗生素：氨曲南 對G-桿菌作用強 頭霉素類：頭孢西

4、丁、頭孢替坦、頭孢美唑 對G+菌和產ESBLS有較好作用 氧頭孢烯類：拉氧頭孢-氧頭孢烯類衍生物 對產-內酰胺酶的G-桿菌有較強的作用，對產酶的金葡菌也有一定作用 碳青霉烯類抗生素：亞胺培南、美洛培南等 對G-桿菌（除嗜麥芽窄食單胞菌外）有很強的活性,三、其他-內酰胺類抗生素,-內酰胺酶抑制劑- 與-內酰胺類抗生素聯(lián)用能增強后者的抗菌活性 克拉維酸 可從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到 舒巴坦 半合成的酶抑制劑 他唑巴坦 半合成的酶抑制劑 青霉素+ -內酰胺酶抑制劑,四、氨基糖苷類抗生素,鏈霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉素 、巴龍霉素 、新霉素 慶大霉素 、福提霉素 阿米卡星、奈替米星、 地貝卡

5、星 革蘭陰性桿菌有強大的抗菌活性 ；革蘭陰性球菌效果差；革蘭陽性球菌有一定活性 大觀霉素、丙大觀霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原體敏感,作用機制,氨基糖苷類抗生素和細菌核糖體30S小亞基發(fā)生不可逆的結合，抑制MRNA的轉錄和蛋白合成；造成遺傳密碼子的錯讀，產生無意義的蛋白質；吸附在菌體表面，造成細胞膜的損傷，導致膜的滲漏，胞內的K+、腺嘌呤等物質外漏。,喹諾酮類抗生素,第一代喹諾酮類抗生素：奈啶酸等 大腸桿菌有作用 第二代喹諾酮類抗生素：環(huán)丙沙星、氧氟沙 星、諾氟沙星等 對G+菌和G-菌均有作用 第三代喹諾酮類抗生素（超廣譜類抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等 對G+菌（如MRS、PRSP、腸球菌

6、）作用強于二代4-8倍,作用機制,作用于DNA旋轉酶,干擾細菌DNA的修復和重組,六、大環(huán)內酯類抗生素,常用的有：紅霉素、麥迪霉素等 主要用于G+菌，對苛養(yǎng)菌及厭養(yǎng)菌有作用，對衣原體、支原體、立克次體、螺旋體等有抑制作用 新一代大環(huán)內酯類抗生素：阿齊霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素等 較紅霉素有更強的抗菌活性,作用機制,大環(huán)內酯類抗生素可逆結合在細菌核糖體50S大亞基的23S單位上,抑制肽酰基轉移酶,影響核蛋白位移,抑制細菌蛋白合成和肽鏈的延伸。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,四環(huán)素類抗生素 廣譜抗生素 米諾環(huán)素 多西環(huán)素等 四環(huán)素類抗生素主要與細菌30S核糖體亞單位結合，阻滯氨?；?/p>

7、轉移RNA與信使RNA核蛋白體的受位位點的結合，阻滯肽鏈延伸，抑制蛋白質合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,氯霉素類抗生素 易進入腦組織 氯霉素 甲砜霉素 氯霉素主要作用于細菌70S核糖體的50S亞基，使肽鏈延長受阻而抑制蛋白質合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,林可酰胺類抗生素 鹽酸林可霉素 克林霉素 G+球菌、白喉桿菌、 破傷風 梭菌、厭氧菌、沙眼衣原體 林可酰胺類抗生素與細菌50S核糖體亞基結合，抑制蛋白質合成，并可干擾肽?；霓D移，阻止肽鏈的 延長。,八、糖肽類抗生素,萬古霉素 替考拉寧 對 G+球菌有強大的活性 多粘菌素B和E G-菌強大的活性 糖肽類抗生素與一個

8、或多個肽聚糖合成中間產物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成復合物，可阻斷肽聚糖合成中的轉糖基酶、轉肽基酶及D-D羧肽酶的作用。,磺胺類藥物及增效劑,用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 用于腸道，口服吸收差：柳氮磺胺啶銀、磺胺二甲氧嘧啶； 局部應用：磺胺米隆、磺胺醋酰鈉,作用機制,磺胺類藥物分子結構中含有對氨基笨磺酰胺，能竟爭性地與二氫葉酸合成酶結合，阻止氨基苯甲酸與二氫葉酸合成酶結合，使菌體內核酸合成重要物質輔酶F（四氫葉酸）鈍化而導致細菌生長受到抑制。 甲氧芐胺嘧啶（TMP）能與二氫葉酸還原酶結合，抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸還原成四氫葉酸受阻而達到抑菌目的。,其他

9、合成抗菌藥,硝基呋喃類：用于腸道、尿路感染和外用 呋喃坦啶、呋喃唑酮 干擾細菌體內的氧化還原酶系統(tǒng)，阻斷細菌的代謝，產生抑殺細菌的作用,其他合成抗菌藥,硝基咪唑類：甲硝唑、替硝唑 用于厭氧菌 硝基咪唑類藥物被厭氧菌還原而阻斷DNA合成，從而阻止DNA的轉錄復制，導致細菌死亡。 替硝唑可干擾DNA合成，并能穿透細胞膜，快速進入細胞內。,第二節(jié) 抗菌藥物敏感性試驗,抗菌藥物敏感性試驗的意義 試驗常規(guī)抗菌藥物選擇 抗菌藥物敏感性試驗的方法 肉湯稀釋法 瓊脂稀釋法 紙片瓊脂擴散法 E試驗,抗菌藥物敏感性試驗的意義,預測療效 指導醫(yī)生合理選擇抗生素 耐藥監(jiān)測，分析耐藥變遷，掌握耐藥菌感染的流行情況，控制

10、預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行,試驗常規(guī)抗菌藥物選擇,根據NCCLS標準： A組：常規(guī)首選藥物 B組：臨床使用主要抗生素 C組：對A組藥物耐藥的流行菌株，對A組過敏的病人和不常見的細菌 U組：僅用于尿道中分離的細菌,方法：肉湯稀釋法,常量稀釋法和微常量稀釋法 培養(yǎng)基：M-H肉湯（苛養(yǎng)菌加添加劑） 藥物稀釋 藥物原液制備 稀釋抗菌藥物 菌種接種 （對數生長期，5X105 CFU/ML） 結果判斷,方法：瓊脂稀釋法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂（苛養(yǎng)菌加添加劑） 含藥瓊脂制備 菌種接種（對數生長期 0.5麥氏單位） 結果判斷,方法：紙片瓊脂擴散法,試驗原理：將含有抗菌藥物的紙片貼于已接種 測試菌的瓊脂平板上，紙

11、片中藥物吸收瓊脂中 水分后向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度， 在紙片周圍抑菌濃度范圍內，測試菌的生長被 抑制，形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。,紙片瓊脂擴散法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂 抗菌藥物紙片 菌種接種 結果判斷和報告,方法： E試驗,原理：結合稀釋法和擴散法原理對微生物藥 物敏感性試驗直接定量的技術 E試條：無孔載體上固定有一系列預先制備 的，濃度呈連續(xù)指數增長稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度。 細菌接種和加樣 結果判斷和報告,E,F,B,C,A,D,MIC,E test法,MIC,ETST,藥物敏感性試驗結果解釋,敏感：測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后，在機體內達到的血藥濃度所抑制或殺

12、滅。 耐藥：測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。 中介：提示該細菌對常規(guī)用藥后，體液或組織中的藥物濃度的反應低于敏感株，但在一些部位（如尿液中的喹諾酮類）或使用高于正常給藥量（如-內酰胺類）臨床上使用有療效。,聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗,聯(lián)合藥物敏感試驗的意義 治療混合感染 預防和推遲抗生素耐藥性的發(fā)生 可減少劑量以避免達到中毒劑量 比單一用藥時效果更好,聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗,抗菌藥物聯(lián)合應用可出現(xiàn)4種結果： 無關作用 拮抗作用 累加作用 協(xié)同作用 最低殺菌濃度測定,監(jiān)控抗生素的治療效果試驗,血清抗菌藥物濃度測定 1、微生物測定法 2、熒光偏振免疫測定 3、高壓液相層

13、析法 4、均相酶免疫測定法 血清抗菌活性測定,自動化儀器檢測,自動化儀器Microscan 、Vitek都有測定MIC功能和檢測ESBL的專用孔和專家系統(tǒng)。,第三節(jié)細菌的耐藥性和產生機制,專題講座,第四節(jié)細菌的耐藥性檢查方法,特殊耐藥菌檢測,對MRSA/MRSE檢測 青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRSP）檢測 對萬古霉素耐藥的腸球菌(VRE)檢測 ESBLS檢測 Ampc檢測,一、MRSA/MRSE檢測,1、正確鑒定葡萄球菌 2、MRSA/MRSE的鑒定 高滲培養(yǎng)基（24%Nacl） 較低的孵育溫度（3335攝氏度） 時間：MRSA 24h MRSE 48h,檢測MRSA/MRSE的方法,甲氧西林

14、或苯唑西林篩選RSA/MRSE 標準紙片擴散法 微量肉湯稀釋法,甲氧西林或苯唑西林篩選MRSA/MRSE,MH瓊脂+4% Nacl+苯唑西林 6g或甲氧西林10g 用0.5McFarland菌液接種35 孵育24h 肉眼可見的菌落生長即為MRS,標準紙片擴散法,在M.H瓊脂(2% Nacl)上用0.5McFarland的 菌液劃線接種。 貼上甲氧西林或苯唑西林紙片（1g），35孵育24h。 苯唑西林抑菌圈小于或等于10mm。 甲氧西林抑菌圈小于或等于9 mm。,微量肉湯稀釋法,M.H肉湯+2%Nacl+苯唑西林或甲氧西林。 用0.5Mcfarland菌液接種，35孵育24h MIC：苯唑西林4

15、g/ml 甲氧西林16g/ ml,二、對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRP）的檢測,篩選：苯唑西林紙片預測肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性 方法:用含1g苯唑西林紙片,標準KB法作藥敏試驗,結果：抑菌環(huán)20 mm敏感 MIC 19 mm作肉湯或瓊脂稀釋試驗測MIC 藥物的選擇：青霉素、四環(huán)素、紅霉素、TMP/SMZ、頭孢菌素和萬古霉素。,肺炎鏈球菌對青霉素的敏感株(MIC:0.03-0.06g/ml)對氨芐西林阿莫西林阿莫西林/克拉維酸第二三代頭孢菌素和泰能敏感.,肺炎鏈球菌對青霉素的MIC值1.0g/ml的肺炎鏈球菌稱為耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRP) MIC值在0.12-1.0g/ ml之間的菌株為相

16、對耐藥(低耐)菌株(PIP) MIC0.6g/ ml為敏感株,三、對萬古霉素耐藥的腸球菌,耐藥性可分為低水平耐藥(MIC8-32mg/L) 高水平耐藥(MIC64mg/L) 根據腸球菌對萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥基因，VRE分為四個表型，分別是VanA VanB VanC VanD,VRE:的分型及其耐藥表型,類型 萬古霉素（g/ ml） 替考拉寧 VanA R（64-1000） R（16-512） VanB R（4-1024） S（0.25-2） VanC I （2-32） S (0.12-2) VanD （16-64） S（2-4）,VRE的檢測方法： 稀釋法，紙片擴散法 Et

17、est 和自動化儀器 VanABC（Etest和瓊脂篩選法最好，敏感率為100%）,稀釋法VRE篩選試驗 （瓊脂稀釋法）,1、BHI瓊脂+6ug/ ml萬古霉素 2、用0.5 Mcfarland菌液接種，35 24h 3、 1個菌落 R 肉湯：生長 R,VRE篩選陽性必須做MIC確認，并觀察動力和色素，以區(qū)分獲得性耐藥（VanA 、VanB）,及某些菌種存在的固有的中介（8-16g/ ml）耐藥（VanC）,兩者在感染控制中意義不同。,四、ESBLS檢測,（一）初篩試驗 1.儀器 MIC2g/ ml 2.紙片擴散法 頭孢泊肟或頭孢他啶22 mm 頭孢曲松25 mm 頭孢噻肟或氨曲南27mm,四

18、、ESBLS檢測,（二）確證實驗 頭孢他啶（CAZ） 頭孢他啶+克拉維酸（CAZ/CLV） 頭孢噻肟（CTX） 頭孢噻肟+克拉維酸（CTX/CLV） 差值5mm 確定為ESBLs,五、Ampc 檢測,三維實驗 制粗提酶： 將50ul0.5麥氏單位待測菌液加入12ml肉湯中 35搖床上震搖4-6h，離心4000轉/min 集菌 -80反復凍溶5次， 4 10000轉/min 離心收集上清液-20保存。,2.檢測AMP C酶 在MH平板上均勻涂抹0.5麥氏單 位ATCC25922 中心貼頭孢西叮紙片 在距紙片5mm處切槽 將粗提酶液加入槽內 35孵育24h 如果在抑菌圈內有細菌生長，則AMP C 陽性。,第五節(jié) 抗分枝桿菌藥物敏感性試驗,抗分枝桿菌藥物 一線藥： 異煙肼、 利福平、 吡嗪酰胺、 乙胺丁醇、 鏈霉素 二線藥： 氨基水楊酸、 乙硫異煙胺、 環(huán)絲氨酸、 卷曲霉素、 卡那霉素 、 利福噴丁,結核分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌體外抑菌試驗,結核分枝桿菌體外藥敏試驗指針 結核分枝桿菌體外藥敏試驗方法 培養(yǎng)基 Middlebrook