致畸試驗#優(yōu)選資料

1、第七節(jié) 致畸試驗 掌握致畸試驗的內(nèi)容。 致畸試驗（teratogenic test)：是鑒定動物致畸物的標(biāo)準試驗法，下述的致畸試驗方案用以檢測藥物的致畸性，也能得到有關(guān)藥物致胚胎死亡及生長遲緩的資料。 一、實驗動物 理想的致畸實驗動物對藥物的代謝過程應(yīng)與人相近，胎盤結(jié)構(gòu)亦相似，產(chǎn)仔多、孕期短、價廉、來源易及操作方便。在代謝功能與解剖結(jié)構(gòu)方面，比較符合要求的動物是狗和猴；符合經(jīng)濟實用要求的是兔、大鼠、小鼠及豚鼠。但小動物有不足之外，如兔自發(fā)畸形率較高，有時孕期長短不定（32-36天），大鼠對致畸作用有較大耐受性；小鼠對致畸反應(yīng)介于兔與大鼠之間，自發(fā)畸形略高于大鼠；豚鼠胎盤結(jié)構(gòu)與人相近，但孕期長（

2、6O天左右）產(chǎn)仔少（4只）。 常用大鼠，小鼠和兔。特別是大鼠，因為大鼠自發(fā)畸形率低，胎鼠大小也適于檢查。雌性動物宜用成年末懷過孕的動物。 動物選擇要求對藥物敏感性高，而自發(fā)畸變形率低，至少采用兩種動物，一種嚙齒類，另一種要求非嚙齒類。 二、動物受孕及檢查方法 以大鼠為例，選用鼠齡三個月以上，體重200-250g雌鼠，飼養(yǎng)數(shù)天后作陰道分泌物涂片檢查，以判斷是否處于動情期。如涂片見有較多白色分泌物，鏡檢發(fā)現(xiàn)有較多核上皮細胞，提示雌鼠處于動情前期。大鼠性周期一般為4-5天，動情前期向動情期移行多在夜間。處于動情前期的鼠按2:1或3:2比例與同齡雄鼠同籠過夜，次日檢查是否受孕。 檢查受孕方法有兩種。一

3、是檢查陰栓，陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒，大鼠的陰栓很易脫落，次日可于鼠籠下的糖瓷盤內(nèi)發(fā)現(xiàn)，小鼠的陰栓不易脫落，位置較深時用鑷子撐開陰道口方能看清。二是陰道涂片檢查精子，可用棉簽插人陰道轉(zhuǎn)動數(shù)次后拔出，涂抹在滴有生理鹽水的玻片上，在低倍鏡下查找精子。 查到陰栓或精子即提示懷孕，檢出日為孕期的“0天”，次為第1天，以此推算孕齡。受孕率在春、秋季較高（可達70以上）夏、冬季較低(50%），所以也可采用人工控制溫度（23左右）及光線，讓雌雄動物每天同籠6小時后作陰道涂片，以提高受孕率并便于在白夭工作。 三、劑量分組，給藥方式及時間 受試動物分為4-5組，其中3

4、個劑量組（高、中、低），其余兩組為陽性對照和陰性對照組。高劑量組應(yīng)有母體毒性反應(yīng)，或為最大給藥量。攝食量的減少，體重增長緩慢或下降，陰道出血，流血等均是毒性反應(yīng)的表現(xiàn)；低劑量組應(yīng)為母體和胚胎毒性反應(yīng)劑量。一般為臨床擬用劑量的某些倍量。中間劑量應(yīng)在高、低劑量組之間，劑量組間距應(yīng)為幾何級數(shù)，并能顯示微小的毒性差別。也可用LD50的1/3-1/5為高劑量組，低劑量組用1/30-1/100LD50，按等比差在高、低劑量組間插進中間劑量，以期得出最小致畸劑量或最大無作用劑量。如已掌握或能估計人類實際接觸量，也可以人實際接觸量（或估計量）為低劑量組，并以其數(shù)倍（如10倍）為高劑量組。 陰性對照組為溶劑（賦

5、形劑）對照。陽性對照可用乙酞水楊酸(大鼠250mg/kg,小鼠150mg/kg),維生素A(濃魚肝油5m1/kg)。家兔可用6-氨基煙酰胺（2.5mg/kg）。已經(jīng)進行過致畸試驗，并確知所用的試驗動物對致畸物有陽性結(jié)果的實驗室可略去陽性對照，每組受孕動物數(shù)大鼠和小鼠15-20只，兔8-10只，狗和猴3-4只。 染毒途徑應(yīng)根據(jù)受試物的性質(zhì)及人類可能的接觸方式而定，一般多用灌胃和腹腔注射。染毒時間應(yīng)選擇胚胎對致畸物的易感期（器官形成期）。大、小鼠和兔進行致畸試驗的日程安排見。 每只試驗動物在試驗期間都應(yīng)有準確記錄受精日期，給予受試物日期和劑量，給藥后動物的體重應(yīng)每隔3-4天稱一次（0,3,7,10

6、,13、16,20），并根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，另一方面也可對受試物動物受精后懷孕與否及受試物對胚胎發(fā)育有無影響作出初步估計，如懷孕胚胎發(fā)育正常，則受試動物的體重可明顯地持續(xù)增長；若胚胎中毒死亡或流產(chǎn)，母體體重則停止增長以至下降。 四、觀察 對母體的觀察：每天檢查有無中毒癥狀，對有流產(chǎn)或早產(chǎn)征兆者（如見陰道出血），及時處死檢查。 對胎仔的觀察：于分娩前1-2日處死受孕動物，以防止自然分娩后母鼠吞食畸形仔鼠。剖腹取出子宮和卵巢，稱重辨認子宮內(nèi)的活胎、死胎及吸收數(shù)，并從左側(cè)子宮角頂端開始直到右側(cè)子宮頂端，按順序編號記錄：然后檢查和記錄黃體數(shù)。 活胎：完整成形，肉紅色，看自然運動，對機械刺激有運動反應(yīng)

7、；胎盤紅色，較大。 晚死胎：完整成形，灰紅色，無自然運動，對機械刺激無反應(yīng)；胎盤灰紅色，較小。 早死胎：紫褐色，未完整成形，無自然運動，胎盤暗紫。 吸收胎：暗紫或淺色點塊，不能辨認胚胎和胎盤。 黃體：在卵巢表面呈黃色魚子狀突起，提示孕鼠的排卵數(shù)。 活胎的外觀畸形并記錄的類型、部位及程度。將每只母鼠的2/3活胎剝?nèi)テつw和內(nèi)臟，經(jīng)茜素紅染色及脫水透明后，檢查骨骼畸形；余1/3活胎浸人鮑音氏(Bouin)固定液，供檢查內(nèi)臟畸形。常見的外觀、骨骼和內(nèi)臟見表18-6、表18-7、表18-8。由于目前沒有充分證據(jù)表明骨骼對致畸物比內(nèi)臟更敏感，因此，有人主張將來自兩個子宮角的胎鼠隨機分配到骨骼畸形檢查中。現(xiàn)

8、將胎仔的外部檢查及骨骼和內(nèi)臟畸形檢查的具體方法敘述如下： 胎仔外部檢查：將處死（或深度麻醉）的試驗動物剖腹暴露子宮，進行下列的檢查和記錄。 確定懷孕情況、順序編號依次鑒別檢查活胎數(shù)，早期死胎數(shù)，晚期死胎數(shù)和吸收胎數(shù)。 剪開子宮，按編號順序，對胎仔逐一檢查記錄性別、體重、身長、尾長和全窩胎盤總量。 對活胎仔由頭部、軀干、四肢、尾部進行外觀檢查，各部位常見的畸形見表18-6。 (2)胎仔的骨骼檢查：胎仔的骨骼檢查是致畸試驗一項重要觀察內(nèi)容，一般是將每窩胎仔的1/2或2/3數(shù)量留作此項檢查。 其具體方法如下： 將留作骨骼檢查的胎仔放入75%-90%的乙醉溶液中進行固定，時間2-5天。 固定好的胎仔置

9、于1%的氫氧化鉀溶液中3-10天，直至肌肉透明可見骨骼為止。在此期間依據(jù)情況可更換1%,氫氧化鉀溶液數(shù)次，每次更換溶液時將胎仔脫落的皮膚洗去。 經(jīng)1氫氧化鉀溶液處理后的胎仔，用茜素紅進行染色直至骨骼染成桃紅色或紫色為止，一般需2-5天，必要時中間須更換新染色液數(shù)次。 茜素紅染色液的配制：將茜素紅加人下面混合液中至飽和為止。 冰醋酸 5m1 純甘油 10ml 1水合氯醛 60ml 使用時取上述茜素紅飽和溶液lml，加1%氫氧化鉀溶液至1000ml混合配成應(yīng)用液。 經(jīng)染色后的胎仔置于以下透明液中1-2天。若透明不夠滿意時，可適當(dāng)延長在透明液中的時間。 透明液I：甘油20分，2 %氫氧化鉀溶液3分，

10、蒸餾水77分。 透明液II：甘油50分，2%氫氧化鉀溶液3分，蒸餾水47分。 透明液III：甘油75分，蒸餾水25分。 經(jīng)上述處理的胎仔骨骼標(biāo)本，可在肉眼或放大鏡，解剖顯微鏡下觀察檢查。注意檢查各骨骼的狀態(tài)，大小，數(shù)量有無異常及骨化程度。 (3)胎仔的內(nèi)臟檢查：經(jīng)外觀檢查后的胎仔隨機法將胎仔數(shù)1/2或1/3置于鮑音(Bouin）氏液中 固定1-2周后，即可用徒手切片觀察方法進行檢查，其具體方法如下： 頭部器官的檢查一通過以下切面來進行觀察檢查。 戴橡皮手套取出固定好的胎仔標(biāo)本，在自來水下洗去固定液，用單面刀徒手沿口經(jīng)耳作一水平切面，這一切面將口腔上下愕分開，主要檢查有無愕裂，舌缺或分叉。 把上

11、述切面切下的顱頂部，沿眼球前沿垂直作額狀切面，這一切面著重檢查鼻道有無畸形，如鼻道擴大、單鼻道等。 沿著眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球有無畸形，如少眼，小眼，無眼。檢查有無腦積水，有無腦室擴大。 沿眼球后緣垂直作第三個額切面，檢查有無腦水腫積水，有無腦室擴大。 胸腔、腹腔和盆腔檢查沿胸、腹壁中線和肋下緣水平線作“十”字切開胸腹，暴露胸腔、腹腔及盆腔內(nèi)的器官，然后逐一檢查各主要臟器的位置、數(shù)目、大小勻稱性及形狀等有無異常。 五、結(jié)果評定 主要計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計算畸胎總數(shù)時，每一活胎仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形，均作為一個畸胎。計算畸形總數(shù)時，在同一活胎仔出現(xiàn)一種畸形，作為一個畸形計算

12、，如出現(xiàn)兩種或兩個畸形，即作為兩個畸形計算，并依此類推。計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)的同時，必須考慮其有無劑量一效應(yīng)關(guān)系，更重要的是按下列指標(biāo)與對照組進行比較： 1對各組母動物需統(tǒng)計如下指標(biāo) 交配成功動物及交配率。 死亡動物數(shù)及死亡率。 剖檢母動物的平均體重及孕期體重增長值或母體增重。 母體增重（g）處死時母體體重-妊娠第日體重-處死時子宮連胎重 母體畸胎出現(xiàn)率，主要根據(jù)出現(xiàn)畸胎的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時，同一母體不論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多種畸形，一律按一個出現(xiàn)畸形胎仔的母體計算。 2對各組胎仔需統(tǒng)計如下指標(biāo) 平均活胎數(shù)及活胎率 吸收胎數(shù)和吸收胎率 死胎數(shù)和死胎率。 外觀

13、畸形率、骨骼畸形率、內(nèi)臟畸形率 3實驗組及對照組的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析 不同指標(biāo)用不同的顯著性檢驗方法處理。平均體重、平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)、平均活胎數(shù)、平均活胎體重用t檢驗：妊娠率、交配率、受孕率、活胎率、用2檢驗；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非參數(shù)統(tǒng)計?？赡軙r計算劑量一效應(yīng)關(guān)系。 根據(jù)上述指標(biāo)計算后，最后評定結(jié)果，確定此種受試物是否具有致畸作用，尚要注意下列間題： (1)致畸作用具有劑量與效應(yīng)關(guān)系，所以，對任何畸形的出現(xiàn)是否具有劑量一效應(yīng)關(guān)系應(yīng)該充分考慮更重要的是必須經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)處理，肯定試驗組出現(xiàn)致畸胎的母體顯著高于對照組，并且試驗組動物活胎仔出現(xiàn)的畸形率應(yīng)顯著高于對照組，才可考慮其致畸作用。

14、 (2)每個實驗室應(yīng)掌握所用試驗動物長期以來的自然畸形發(fā)生情況，包括自然出現(xiàn)的畸形類型和頻率。試驗組動物出現(xiàn)的畸形，如長期以來在對照組動物未曾出現(xiàn)過，則對受試物致畸作用，更應(yīng)認真對待；反之，則應(yīng)慎重做出結(jié)論。 (3)生物體常有變異現(xiàn)象，變異是群體中個體間的差異。特別是同一物種內(nèi)一個體與另一些個體的差異。變異為基因所控制，具有適應(yīng)和進化的意義，與外來化合物干擾胚胎正常生長發(fā)育所引起的畸形完全不同，有人認為肋骨椎骨數(shù)目比正常多一個或少一個等現(xiàn)象皆屬于變異，不能做為致畸。但變異出現(xiàn)率一般較低，也不呈現(xiàn)劑量與效應(yīng)關(guān)系，借此可將兩者加以區(qū)別。 (4)致畸作用中存在種屬差異，而且同種動物的品系間亦有差異。

15、因此，在一種動物出現(xiàn)致畸作用后，最好在另一種動物再進行試驗或至少在同種動物再重復(fù)進行試驗。如結(jié)果一致，才可以認為對動物確有致畸作用。 由于致畸作用存在種屬差異，所以任何外來化合物對動物具有致畸作用，不一定對人類致畸。一方面應(yīng)進一步進行人群流行病學(xué)調(diào)查，以確定其在人體的致畸作用；另一方面應(yīng)認識致畸作用是外來化合物的毒性表現(xiàn)的一種。凡是對動物具有致畸作用的化合物，也應(yīng)看作對人體致畸的可能，故應(yīng)采取各種措施，使人類盡量減少與其接觸，這一問題涉及動物致畸試驗結(jié)果推論到人的問題。動物試驗結(jié)果推論到人的間題，目前在毒理學(xué)中極為重視面研究也極為活躍。雖然有人提出許多方法或途徑，但迄今為止，還沒有建立一個簡單的方法，將動物試驗結(jié)果推算到人。致畸作用也是如此，絕對不能簡單地將小鼠，大鼠或其它動物的實驗結(jié)果直接應(yīng)用于人?，F(xiàn)參考歐洲經(jīng)濟共同體和經(jīng)濟合作開發(fā)組織所建議的致畸物分級標(biāo)準，且加以綜合。注意其在實際工作中僅能做為參考，必須結(jié)合實際情況，分析思考，靈活運用。 (6)將一種外來化合物對人類的致畸作用進行最后評定，決定取舍時，應(yīng)該特別注意人類實際接觸劑量