生物化學(xué)--酶1

1、Enzyme,第 四 章 酶,酶學(xué)研究簡史,公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。 一百余年前，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵是酵母細(xì)胞生命活動的結(jié)果。 1877年，Kuhne首次提出Enzyme一詞。 1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。 1926年，Sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶。 1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。,第一節(jié) 酶是生物催化劑,一、酶的生物學(xué)意義 在體外的化學(xué)反應(yīng)

2、需要高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等強(qiáng)烈的條件才能進(jìn)行，而在生物體內(nèi)雖然條件十分溫和，許多復(fù)雜的化學(xué)變化卻進(jìn)行的順利而迅速。 根本原因是生物體內(nèi)普遍地存在著生物催化劑酶；酶能在機(jī)體中十分溫和的條件下高效率地起催化作用。 研究酶的化學(xué)性質(zhì)及作用機(jī)理，對了解生命活動的規(guī)律及醫(yī)學(xué)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。,二、酶是生物催化劑,（一）酶和一般催化劑的比較 共性： 1用量少而催化效率高 2不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點，酶本身在反應(yīng)前后不發(fā)生變化 3可降低反應(yīng)的活化能 活化能：在一定溫度下一摩爾底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能,活化能：底物分子從初態(tài)轉(zhuǎn)變到活化態(tài)所需的能量。,酶為什么能催化生化反應(yīng),(二)酶作為生物催化劑的特

3、性,1.催化效率高 酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)高108-1020倍，比其他催化反應(yīng)高107-1013倍。 轉(zhuǎn)換數(shù)：kcat，每秒鐘每個酶分子能催化多少個微摩爾的底物發(fā)生變化 大部分酶的轉(zhuǎn)換數(shù)為1000，最大的可達(dá)幾十萬，甚至一百萬以上 2酶的作用具有高度的專一性 一種酶只能作用于某一類或某一種特定的底物。 被酶作用的物質(zhì)稱為該酶的底物,3酶易失活 使蛋白質(zhì)變性的因素都能使酶破壞而失活 酶作用一般都要求比較溫和的條件，如常溫、常壓、接近中性的酸堿度 4酶活力的調(diào)節(jié)控制 酶活力是受調(diào)節(jié)控制的，調(diào)控方式包括抑制劑調(diào)節(jié)、共價修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制 5酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬

4、離子有關(guān),三、酶的化學(xué)本質(zhì),目前將生物催化劑分為兩類 酶 、 核酶（脫氧核酶）,（一）酶的蛋白質(zhì)本質(zhì) 酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對其特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)。,（二）酶的組成分類,根據(jù)其組成成分分為：簡單蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì) 活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶，屬于簡單蛋白質(zhì)。 一些酶在結(jié)合非蛋白組分(輔助因子)后，才表現(xiàn)出酶活性，這類酶屬于結(jié)合蛋白質(zhì)，其酶蛋白與輔助因子結(jié)合后形成的復(fù)合物稱為“全酶”,*各部分在催化反應(yīng)中的作用,酶蛋白決定反應(yīng)的特異性 輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì),（三）根據(jù)酶蛋白分子的特點分類,1.單體酶(monomeric enzyme)：僅具有三級結(jié)構(gòu)的酶。一條肽鏈

5、2.寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多個相同或不同亞基以非共價鍵連接組成的酶。 3.多酶體系(multienzyme system)：由幾種不同功能的酶彼此聚合形成的多酶復(fù)合物。 4.多功能酶(multifunctional enzyme)或串聯(lián)酶(tandem enzyme)：一些多酶體系在進(jìn)化過程中由于基因的融合，多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。,（四）酶的輔助因子,酶的輔助因子包括金屬離子及有機(jī)化合物； 輔助因子本身無催化作用；但在酶促反應(yīng)中運輸轉(zhuǎn)移電子、原子或某些功能基 有些蛋白質(zhì)也具有此種作用，稱為蛋白輔酶,輔助因子分類 （按其與酶蛋白結(jié)合的緊

6、密程度）,輔酶 (coenzyme): 與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去。,輔基 (prosthetic group): 與酶蛋白結(jié)合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。,第二節(jié) 酶的分類及命名,一、習(xí)慣命名法: 1,根據(jù)其催化底物來命名； 2,根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名； 3,結(jié)合上述兩個原則來命名， 4,有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。,二、國際系統(tǒng)命名法,系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。 例如： 習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名稱:丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶催化的反應(yīng): -酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸,一些酶的命名舉例,酶的分類 1.氧化還

7、原酶類(oxidoreductases) 2.轉(zhuǎn)移酶類 (transferases ) 3.水解酶類 (hydrolases) 4.裂解酶類 (lyases) 5.異構(gòu)酶類( isomerases) 6.合成酶類 (ligases, synthetases),三、國際系統(tǒng)分類法及編號,將所有的酶促反應(yīng)按反應(yīng)性質(zhì)分為六大類，分別用l、2、3、4、5、6的編號來表示。 再根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點將每一大類分為若干個亞類，每一個亞類又按順序編成l、2、3、4等數(shù)字。每一個亞類可再分為若干個亞-亞類中仍用l、2、3、4編號。 每一個酶的分類編號由四個數(shù)字組成，數(shù)字間由“.”隔開。 編號之前以E

8、C(如EC2.6.1.2),酶的六個大類及其亞類 1氧化還原酶類 催化氧化還原反應(yīng)。 A2H + B A+B2H 如：乳酸脫氫酶,2移換酶類,移換酶類催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。 AB+C A+BC 丙氨酸：酮戊二酸氨基移換酶,3.水解酶類,水解酶類催化水解反應(yīng)。 這類酶包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶 AB+HOH AOH+BH 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：,4. 裂合酶,裂合酶催化從底物分子中移去一個基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng) 主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等 例如，延胡索酸水合酶催化的反應(yīng),5. 異構(gòu)酶 Isomerase,異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子

9、內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。 例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。,6. 合成酶 Ligase or Synthetase,合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A+B+ATP+H-O-H=AB+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,7.核酸酶（催化核酸） ribozyme,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。,第三節(jié) 酶的分離提純及活力測定,一、酶的分離提純,對酶進(jìn)行分離提純有兩方面的目的 一是為了研究酶的理化特性，對

10、酶進(jìn)行鑒定，必須用純酶 二是作為生化試劑及用作藥物的酶，常常也要求有較高的純度,酶的分離提純步驟,1.選材 2.破碎細(xì)胞 3.抽提：低溫下用水或低鹽緩沖液粗提 4.分離提純：低溫下進(jìn)行 5.保存：-20度低溫保存 （1）保存濃縮酶液 （2）冰凍干燥 （3）加入甘油,二、酶活力的測定,1.酶活力與酶促反應(yīng)速度 酶活力是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度。,酶促反應(yīng)速度可在適宜的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量來表示。 研究酶反應(yīng)速度應(yīng)以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn) 一般以測定產(chǎn)物為好,2.酶的活力單位,酶的活性單位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位

11、時間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg、g、mol等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。,國際單位(IU) 在特定的條件下，每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位。,3.酶的比活力,比活力的大小，也就是酶含量的大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力，一般用(Umg蛋白質(zhì))來表示。 酶的比活力可以用來比較每單位重量蛋白的催化能力。對同一種酶來說，比活力愈高，表明酶愈純。,4.酶的轉(zhuǎn)換數(shù)kcat,轉(zhuǎn)換數(shù)為每秒鐘每個酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù),第四節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué) Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,概念 研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，并

12、加以定量的闡述。 影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、pH、溫度、 抑制劑、激活劑等。, 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。,一、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響,單底物、單產(chǎn)物反應(yīng) 酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來表示 反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?以內(nèi)）時的反應(yīng)速度 底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度,研究前提,在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時,反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。,目 錄,隨著底物濃度的增高,反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。,目 錄,當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度

13、,反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng),目 錄,二、米氏方程式,中間產(chǎn)物,酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說 反應(yīng)分兩步進(jìn)行,米曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)： E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即 Vk3ES。 (1) S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即SSt。,1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物濃度 v：不同S時的反應(yīng)速度 Vmax：最大反應(yīng)速度(maximum vel

14、ocity) m：米氏常數(shù)(Michaelis constant),推導(dǎo)過程,穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成速度與分解速度相等，即 ES恒定。 K1 (EtES) SK2 ES + K3 ES,則(2)變?yōu)? (EtES) S Km ES,當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時，即EtES，反應(yīng)達(dá)最大速度 VmaxK3ESK3Et (5),將(5)代入(4)得米氏方程式： Km是米氏常數(shù),當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時,三、米氏常數(shù)的意義 米氏常數(shù)Km值的推導(dǎo),KmS,Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。,Km值 Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。

15、 意義： a) Km是酶的特征性常數(shù)之一； b) Km值受外界環(huán)境的影響； c) 同一酶對于不同底物有不同的Km值， Km值最小的底物為最適底物。,d) 對因為有抑制劑存在或其他原因偏離米氏方程的，用表觀米氏常數(shù)Km代替Km e) Km值與米氏方程的用途 可由所要求的反應(yīng)速度，求出應(yīng)加入底物的合理濃度，或反推,四、m的求法,1. 雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plot)，又稱為 林-貝氏(Lineweaver- Burk)作圖法,2. Hanes作圖法,在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘S,S/ v =Km/Vmax + S/Vmax,五、多種底物的反應(yīng),大多數(shù)酶反應(yīng)是比較復(fù)雜的

16、，一般包含有一種以上的底物，至少且是兩種底物 A+B P+Q 雙底物反應(yīng)有三種反應(yīng)機(jī)理： 依次反應(yīng)機(jī)理 隨機(jī)機(jī)理 乒乓機(jī)理,E,1.依次反應(yīng)機(jī)理,需要NAD+或NADP+的脫氫酶反應(yīng)：,E + A EA EAB EPQ EQ E + Q,B P,2.隨機(jī)機(jī)理,3.乒乓反應(yīng)機(jī)理,E+A EA FP F FB EQ E+Q,P B,六、 pH對酶反應(yīng)速度的影響,最適pH (optimum pH)： 酶催化活性最大時的環(huán)境pH。,pH影響酶活力的原因,1. 過酸、過堿會影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使酶變性而失活 2當(dāng)pH改變不很劇烈時，酶雖不變性，但活力受影響。因為pH會影響底物分子的解離狀態(tài)，也可能影響

17、到中間產(chǎn)物的解離 3pH影響分子中另一些基團(tuán)的解離，這些基團(tuán)的離子化狀態(tài)與酶的專一性及酶分子中活性中心的構(gòu)象有關(guān),雙重影響 溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。,七、溫度對酶反應(yīng)速度的影響,最適溫度 (optimum temperature)： 酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。,酶在干燥時對溫度耐受性高,八、酶濃度對酶反應(yīng)速度的影響,當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。 關(guān)系式為：V = K3 E,九、激活劑對酶反應(yīng)速度的影響,激活劑：能提高酶活性的物質(zhì)，大部分是離子或簡單有機(jī)化合物 激活劑按分子大小分為三類： 無機(jī)

18、離子 中等大小的有機(jī)分子 具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì),（一）無機(jī)離子,1. 金屬離子,金屬離子的作用 穩(wěn)定酶的構(gòu)象； 參與催化反應(yīng)，傳遞電子； 在酶與底物間起橋梁作用； 中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。 2.陰離子 3.氫離子,（二）中等大小的有機(jī)分子,1. 某些還原劑：半胱氨酸、谷胱甘肽、氰化物 2. EDTA：金屬螯合劑，解除重金屬離子對酶的抑制作用,（三）具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì),可對某些無活性的酶原起作用的酶 無活性的酶原 有活性的酶,激活作用,十、抑制劑對酶反應(yīng)速度的影響,酶的抑制劑(inhibitor) 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。,區(qū)別于

19、酶的變性,抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有選擇性,（一）抑制作用的類型,1.不可逆性抑制 (irreversible inhibition),2.可逆性抑制 (reversible inhibition)：,競爭性抑制 (competitive inhibition) 非競爭性抑制 (non-competitive inhibition) 反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition),1. 不可逆性抑制作用,* 概念 抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活。 * 舉例 有機(jī)磷化合物 羥基酶 解毒 - - - 解磷定(PAM) 重金屬離子及砷

20、化合物 巰基酶 解毒 - - - 二巰基丙醇(BAL),按照不可逆抑制作用的選擇性不同，可分為 專一性的不可逆抑制 非專一性的不可逆抑制 非專一性抑制劑可以用來很好地了解酶有哪些必須基團(tuán)。另外，非專一性試劑還可用探測酶的構(gòu)象。,2. 可逆性抑制作用,* 概念 抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。,競爭性抑制 非競爭性抑制 反競爭性抑制,* 類型,（）競爭性抑制作用,反應(yīng)模式,定義 抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用,解除 ：增加底物濃度

21、,* 舉例,丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶,（2）非競爭抑制,酶可以同時與底物及抑制劑結(jié)合，兩者沒有競爭作用。 這類抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)相結(jié)合，其結(jié)構(gòu)可能與底物毫無相關(guān)。 大部分非競爭性抑制都是由一些可以與酶的活性中心之外的巰基可逆結(jié)合的試劑引起的。,* 反應(yīng)模式,（） 反競爭性抑制,* 反應(yīng)模式,（二） 一些重要的抑制劑,1. 不可逆抑制劑 當(dāng)這類抑制劑過量地加到酶溶液中后，隨著受抑制酶分子的逐漸增多，抑制作用不斷增強(qiáng)，甚至使酶反應(yīng)停止。 （1）有機(jī)磷化合物 這類化合物強(qiáng)烈地抑制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的膽堿酯酶，使乙酰膽堿不能分解為乙酸和膽堿。乙酰膽堿的堆積，引起一系列神經(jīng)中毒的癥狀，因

22、此這類物質(zhì)又稱為神經(jīng)毒劑。,（2）有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物,路易士氣,巰基酶,失活的酶,酸,（3）氰化物,氰化物與含鐵卟啉的酶(如細(xì)胞色素氧化酶)中的Fe2+結(jié)合，使酶失去活性而阻抑細(xì)胞呼吸。 (4)重金屬 Ag、Cu、Pb、Hg等鹽能使大多數(shù)酶失活，加入EDTA螯合劑后可以解除 (5)烷化劑 其中最主要的是含鹵素的化合物，它們可使酶中-SH基烷化，從而使酶失活。,（6）含有活化作用的不可逆抑制劑 這類抑制劑是潛伏狀態(tài)存在的，當(dāng)它與某些酶的活性中心結(jié)合后就被激活成有抑制活性的抑制劑。 這類抑制劑只是在遇到專一性的靶酶時，才從潛伏態(tài)轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài)。,2可逆抑制劑,可逆抑制劑中最重要及最常見的是競爭性

23、抑制劑 常見的可逆抑制劑有 磺胺類藥物 氨基葉酸 膽堿酯酶的競爭性抑制劑,磺胺類藥物的抑菌機(jī)制 與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,人體能直接利用食物中的葉酸，某些細(xì)菌則不能直接利用外源的葉酸，只能在二氫葉酸合成酶的作用下，利用對氨基苯甲酸合成二氫葉酸 抗菌增效劑TMP可增強(qiáng)磺胺藥的藥效。因為它的結(jié)構(gòu)與二氫葉酸有相似之處，是細(xì)菌二氫葉酸還原酶的強(qiáng)烈抑制劑，但它很少抑制人體的二氫葉酸還原酶。,氨基葉酸是葉酸的競爭性抑制劑，前者用氨基取代了葉酸中蝶呤上的羥基，所以氨基酸可用作抗癌藥物。,利用競爭性抑制是藥物設(shè)計的根據(jù)之一 膽堿酯酶的競爭性抑制劑，其結(jié)構(gòu)類似于正常底物乙酰膽堿。 膽堿酯酶的抑制劑都含有甲基化的季銨基團(tuán)或堿性氮原子或類似的酯鍵。,（三）可逆抑制作用的動力學(xué),1.競爭性抑制,* 特點,I與S結(jié)構(gòu)類似，競爭酶的活性中心；,抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及底物濃度；,動力學(xué)特點：Vmax不變，表觀Km增大。,用1/V對1/S作圖 斜率：,橫截距：