如何構(gòu)建質(zhì)?？寺?ppt

1、如何構(gòu)建質(zhì)?？寺?周鴻雁 2011.06.15,目的基因,目的載體,Bax,pCMV-Sport 6,EcoR,Bgl,連接Bax基因至EGFP載體 思路,加入 EcoR酶切位點(diǎn),加入 Bgl 酶切位點(diǎn),連接 酶切 目的基因兩側(cè)加入酶切位點(diǎn),MCS 多克隆位點(diǎn),Bax,pCMV-Sport 6,缺點(diǎn)： 無熒光：GFP、Dsred 無標(biāo)簽: Flag、 HA、 Myc,pCMVSPORT6 MCS,Gene： BAX MGC: 20956, IMAGE:4578562 Insert site：EcoRI, XhoI,構(gòu)建過程, 設(shè)計(jì)引物 (增加酶切位點(diǎn), Bgl, EcoR) 目的基因PCR 雙

2、酶切載體 (Bgl, EcoR) 瓊脂糖凝膠電泳 DNA 膠回收 ( 基因 ,載體) 雙酶切目的基因 (Bgl, EcoR) 目的基因與載體相連 DH5轉(zhuǎn)化 鑒定,第一步：設(shè)計(jì)目的基因PCR引物目的：1）通過PCR方法擴(kuò)增目的基因2）在目的基因片斷兩端增加酶加位點(diǎn),酶切位點(diǎn)旁需加入保護(hù)堿基,設(shè)計(jì)引物前需解決的問題, 1、選擇酶切位點(diǎn) 2、選擇保護(hù)堿基 3、終止密碼子,PEGFP MCS,選擇酶切插入位點(diǎn)： 1、兩個(gè)酶切位點(diǎn)間隔遠(yuǎn) 2、目的基因序列中無相應(yīng)酶切位點(diǎn) 3、酶切緩沖液一致,BAX insert sequence,atggacgggtccggggagcagcccagaggcgggggg

3、cccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgc

4、ccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga,*,*,DNAStar軟件 - MapDraw功能,AGATCT - Bgl buffer 3 GAATTC

5、-EcoR I buffer 3,AGATCT 目的基因 CTTAAG,AGATCT -目的基因- CTTAAG,PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物酶切效率低、不準(zhǔn)確 ！,酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基,protection seqence: GGAAGATCTTCC 2h=25%, 20h90% CCGGAATTCCGG 2h90%, 20h90%,切割率,提高酶切活性、增加酶切效率、縮短酶切時(shí)間,保護(hù)堿基: 限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點(diǎn)兩邊的若干個(gè)堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響,設(shè)計(jì)引物原則,引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18

6、-27 bp， 引物序列的GC含量一般為40-60% 2. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳 3. 避免引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu) 4. 引物的特異性 5. 堿基隨機(jī)分布,cggcgg tgatggacgg gtccggggag cagcccagag gcggggggcc Primer1 ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG (length -21, GC%-71.8%, Tm-71.4) ggag tgctcaccgc ctcactcacc atctggaaga agatgggctg aggcccccag Primer2 TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGG

7、TG (length -25, GC%-52%, Tm-68.4),設(shè)計(jì)引物 Primer 5軟件,引物中是否應(yīng)包含終止密碼子？,MCS在EGFP之后表達(dá)，需加終止密碼子,MCS在DsRed之前表達(dá)，不可以加終止密碼子,加入保護(hù)堿基及酶切位點(diǎn),Primer 1 GGAAGATCT ATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer 2 CCGGAATTC TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG, MCS與熒光相連的地方應(yīng)特別注意有無移碼,調(diào)整開放閱讀框（ORF）,熒光表達(dá)在前時(shí)(EGFP),Primer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Prim

8、er2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG 因TGA為終止密碼子，所以之后的移碼不需理會,熒光表達(dá)在后時(shí) (DsRed),Primer1 CCGGAATTCatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg,熒光表達(dá)在后時(shí)需加KOZAK 序列,Primer1 CCGGAATTCgccaccatggaggcgctaattcctgtc Primer2 CGCGGATCCCGccaaagatgagtctcccgg KOZAK 序列: gccacc, 加在起始密碼子之前,Primer final,P

9、rimer1 GGAAGATCTATGGACGGGTCCGGGGAGCAG Primer2 CCGGAATTCTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG,33.5 uL dH2O 10 uL phusion HF buffer 1 uL dNTP(10mM) 2.5uL primer forward/ reward 1uL BAX 1.5ul DMSO 0.5uL phusion polymerase 50 uL,1. 98(1min) 2. 98 (5s) 3. 65(20s) 4. 72(20s) 5. back to step 2 for 25 times 6. 72 (10mi

10、n) 7. 18 for ever,第二步：PCR目的基因,Phusion超保真PCR試劑盒,Buffer3 : 2ul vector: 4ul 100%BSA: 0.2ul EcoR : 1ul Bgl: 2ul ddH2O: 10.8ul,37 4h,EcoR,Bgl,第三步：雙酶切載體,20ul,第四步：瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收,0.6% gel 6* loading buffer 50ul sample 80V,目的基因,5kb 2.5kb,載體,Buffer3 : 2ul BAX: 15ul 100%BSA: 0.2ul EcoR : 0.5ul Bgl: 1ul ddH2O: 1.

11、3ul,37 4h,第五步：雙酶切及回收目的基因,20ul,TAKARA片斷回收試劑盒,第六步：回收效率驗(yàn)證,5kb 2.5kb,Loading volume: 5ul,From left to right: Marker: 15000bp EGFP BAX restriction BAX PCR Marker:100bp,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax: 3ul vector: 1ul ddH2O: 13ul,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 6ul vector : 1ul ddH2O

12、: 10ul,T4 ligase buffer : 2ul T4 ligase: 1ul Bax : 10ul vector : 1ul ddH2O: 6ul,(1) (2) (3),16 過夜,第六步：連接,載體100ng:,100 x目的基因分子量,載體分子量,X 4/110/1,目的基因的量為:,第七步：轉(zhuǎn)化,100ul DH5 + 20ul 連接產(chǎn)物,第八步：驗(yàn)證 (1),PCR,1-12,13-24,Positive: 2,7,9,10,5.4 uL dH2O 2 uL phusion HF buffer 0.2 uL dNTP(10mM) 0.5uL primer forward 0.5 uL primer reward 1uL 菌液稀釋液 0.3ul DMSO 0.1uL phusion polymerase 10 uL,第八步：驗(yàn)證 (2)