擬南芥的種植(修正版)

1、一、擬南芥播種 種子裝入dorf管內(nèi)，20l種子加1ml 75% 乙醇消毒1分鐘； 吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸鈉：50%無菌水：0.05%吐溫（or 5%漂白粉），震蕩洗滌15-20分鐘； 稍離心使種子沉于下部，吸去次氯酸鈉或漂白粉，加入無菌蒸餾水清洗（清洗3次，每次洗完后稍離心，吸凈水分）； 將種子用接種環(huán)均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，用封口膜封口，放入4冰箱內(nèi)冷處理2-3天（春化）。 MS培養(yǎng)基的用量：直徑為9cm的培養(yǎng)皿用25ml，直徑為6cm的培養(yǎng)皿用12.5ml。二、MS固體培養(yǎng)基制備1培養(yǎng)基母液的配制和保存 MS培養(yǎng)基含有近30種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這幾十種成分進

2、行稱量，可將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀釋，制成培養(yǎng)液?，F(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的各類物質的量列出，供配制時使用。大量元素(母液，20)mgL NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl22H2O 8 800 MgSO47H2O 7 400 KH2PO4 3 400 微量元素(母液，200) mgL KI 166 H3BO3 1 240 MnSO44H2O 4 460 ZnSO47H2O 1 720 Na2MoO42H2O 50 CuS

3、O45H2O 5 CoCl26H2O 5 鐵鹽(母液，200) mgL FeSO47H2O 5 560 Na2-EDTA2H2O 7 460 有機成分(母液，200) mgL A 肌醇 20 000 B 煙酸 100 鹽酸吡哆醇(維生素B6)100 鹽酸硫胺素(維生素B1)100 甘氨酸 400 上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1 L。 母液的配制方法是：將稱好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙猓?/p>

4、然后將兩種溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。2配制培養(yǎng)液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液為50 mL，母液、A和B各5 mL。3溶化瓊脂4調(diào)pH 用滴管吸取物質的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.47.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止(培養(yǎng)基的pH必須嚴格控制在5.8，因高溫滅菌時pH會下降，所以滅菌前通常pH配成6.2左右)。5.培養(yǎng)基的分裝6高壓滅菌三、擬南芥的種植1人工土配制 18份蛭石，6份黑土和1份珍珠巖混合均勻，分裝于塑料滅菌袋內(nèi)，扎好口，于9

5、8 kPa、121.3 下，滅菌40 min。冷卻后備用。 有時也用兩種土，即上層用不含黑土的人工土，下層用上面所講的土。我估計原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土較難完全粉碎，較大的塊狀土不便于移栽。2PNS營養(yǎng)液：每升含 5ml 1M KNO3， 2ml 1M Ca(NO3)24H2O， 2ml 1M MgSO47H2O， 2.5ml 20mMFe.EDTA， 2.5ml 1M磷酸緩沖液（pH5.5）， 1ml 微量元素 。注意：營養(yǎng)液用煮沸冷卻后的涼開水配置。PNS營養(yǎng)液母液配方： 1MKNO3101.1g 1MCa(NO3)24H2O236.15 g 1MMgSO47H2O，246

6、.48 g 20mMFe.EDTA： FeSO45.57g EDTA7.45g注意先各自配成溶液，再混合。1M磷酸緩沖液（pH5.5）： 磷酸二氫鉀130.4g 磷酸氫二鉀9.12g微量元素 硼酸0.434g 硫酸錳（MnSO4 H2O） 1.7626g CuSO4H2O0.0798g ZnSO47H2O0.172g NaMoO42H2O 0.0432g NaCl 0.585g CoCl6H2O0.00129g以上母液均配至1L種子春化A 取適量種子置于標記好的1.5ml離心管中，加入1 ml 70乙醇輕微振蕩1 minB去乙醇，加入1 ml體積分數(shù)為10的NaClO (次氯酸鈉), 消毒510 min；C吸去NaClO, 用無菌水沖洗種子5次后, 加入600l無菌水；D用1ml移液槍將水連同種子吸起，均勻鋪于MS平板，每皿60100粒種子；E吸去并風干培養(yǎng)基表面多余的水分。F加蓋，封口，4冰箱放置23 d，春化使種子萌發(fā)同步化。土壤培養(yǎng)從春化算起，平板上培養(yǎng)714 d，當幼苗具4片真葉時轉入土壤(1株/盤)進行土培。加蓋保鮮膜1 d，及時澆水。培養(yǎng)條件溫度 ：2022；濕度 ：70左右；光照強度：100120 molm-2sec-1；在長日照條件下（16h光