3 基因克隆的酶學基礎(chǔ)lyw5.ppt

1、第三章 基因克隆的酶學基礎(chǔ),1. 簡述,核酸酶： 通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核苷酸鍵發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。分為兩類：從核酸分子末端開始，一個核苷酸一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈的叫核酸外切酶（exonuclease）;從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫做核酸內(nèi)切酶（endonuclease） 核糖核酸酶（RNase）：水解斷裂RNA分子 脫氧核糖核酸酶：特異水解斷裂DNA分子,核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)賴以創(chuàng)立的酶學基礎(chǔ),限制性內(nèi)切酶主要用于DNA分子的特異切割 DNA連接酶用于連接兩條DNA分子或片段 反轉(zhuǎn)錄酶以RNA

2、分子為模板合成互補的cDNA鏈 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 多核苷酸激酶將一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5-OH末端 堿性磷酸酶催化從DNA分子的5或3端移去末端磷酸基團 核酸酶用于DNA和RNA的非特異性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸末端修飾酶用于DNA和RNA的末端修飾 其它酶類-用于生物細胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。,2. 重組DNA實驗中的工具酶及其運用,第一節(jié) 核酸限制性內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割,1.1 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象,在K株或B株上生長繁殖的噬菌體（K）或（B），再次感染原寄主菌株的成斑率為1，而感染新的寄主菌株的成斑率則分別為10-4和

3、410-4,（K）在感染B菌株后長出的稀有噬菌斑中的噬菌體再次感染B菌株則可以有效地生長,兩種酶的配合：修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶與核酸限制性內(nèi)切酶 （EcoB and EcoK）,1.2 限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1.細菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) Werner Arber于1962-1968年發(fā)現(xiàn)，1968年分離到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的發(fā)現(xiàn) HOSmith 和Wilox 于1970年首次從流感嗜血桿菌（H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindII限制酶。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 D. Nathans（1971年）用HindII繪制SV40的限制酶譜。,國王和仆人的故事

4、分子剪刀,每當我走進父親的辦公室，總會看見他桌上放著的一些培養(yǎng)皿，里面裝的是菌群。它們就象一個住著許多居民的城市，在每一種細菌中都有一個國王，他長得瘦瘦的、高高的。國王有很多仆人，這些仆人長得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父親把國王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。國王就像一本書，仆人們做的每一件事情在這本書中都有記載。對于我們?nèi)祟悂碚f，國王記載的這些細目是個謎。 我爸爸已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了其中的一個仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外國國王來侵犯一個細菌，這個仆人就會把他剪成小碎片，但他不會對自己的國王造成任何傷害。 聰明的人類用這個帶著剪刀的仆人來探究國王的秘密，他們搜集了很多帶剪刀的仆人，并把他們放進一

5、個國王里，這個國王就被剪成了碎片。用這種方法得到的小碎片使人類探究國王的秘密變得容易了。爸爸就是因為發(fā)現(xiàn)了帶著剪刀的仆人而獲得了諾貝爾獎。,瑞士微生物遺傳學家W阿爾伯（1929）的女兒西爾維婭,1.3 核酸內(nèi)切酶的類型,1.4 I型和III型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性,I型和III型核酸限制性內(nèi)切酶一般是大型的多亞基蛋白復(fù)合物，既具有內(nèi)切酶的活性又具有甲基化酶的活性。,I型核酸限制性內(nèi)切酶的特性 輔助因子： Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸） 三種不同的亞基： 特異性亞基：特異識別DNA序列 修飾亞基：具有甲基化酶的活性 限制亞基：具有核酸內(nèi)切酶活性 切割方式：結(jié)合在識別位點以滾環(huán)形

6、式沿著DNA分子轉(zhuǎn)位，而后從距識別位點5一側(cè)數(shù)千堿基處隨機切割DNA分子。,III型核酸限制性內(nèi)切酶的特性,輔助因子： Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸） 兩種不同的亞基： M亞基：位點的識別與修飾 R亞基：核酸酶的活性 切割方式： 反應(yīng)過程中會沿著DNA分子移動，并從距識別位點一側(cè)約25bp處單鏈切割DNA分子。 其識別序列是特異而非對稱的。,1.4 II型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性,II型只有一種多肽，通常以同源二聚體形式存在。,1.在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂； 2.兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的； 3.斷裂形成的D

7、NA片段往往具有互補的單鏈延伸末端。,識別序列：雙重旋轉(zhuǎn)對稱（回文結(jié)構(gòu)）,1. 識別順序和酶切位點 ）識別、6、8個相連的核苷酸,BamHI：,HhaI：,NotI：,Fok I ： 5-()9-3 3-()13-5 外側(cè)，產(chǎn)生-端突起,IIs型,2）對稱性雙對稱 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 3）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 4）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和- 2.末端種類 ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-3 3-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5 ）-端突起，

8、個數(shù)為或個核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,）平齊末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互補的粘性末端 i）切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ii）能識別簡并順序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG,）相容性末端 如：BamHI G GA

9、TCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 。,3 同裂酶（isoschizomers）,定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶 （產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端）,用以研究DNA甲基化作用： 一對同裂酶：HpaII和MspI，識別序列同為CC

10、GG，當靶序列中含一個5-甲基胞嘧啶（CCGG）時，HpaII不能切割它而MspI則同樣能切開，因此可通過比較HpaII和MspI的DNA消化產(chǎn)物來檢測胞嘧啶的甲基化。,4. 同尾酶（isocaudamer）,定義：來源不同,識別不同序列但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶,5. 限制片段末端的連接作用,許多種限制酶切割DNA分子形成的短片段能夠自發(fā)地重新環(huán)化起來，用DNA連接酶處理能使它們的3-OH和5-P基團封閉起來形成永久的環(huán)形DNA分子。 兩種類型：DNA分子間和分子內(nèi),1.5 限制性內(nèi)切酶的命名 命名原則：（1）用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名稱；（2）

11、用一個寫在右下方的標注字母代表菌株或型；（3）幾個不同的限制與修飾體系以羅馬數(shù)字表示。 例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae，“”表示菌系為型血清型；“”表示分離到的第三個限制酶。 EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I (),1.6 影響限制性內(nèi)切酶活性的因素,1. DNA的純度,DNA中的污染組分如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽離子都有可能抑制核酸限制性內(nèi)切酶的活性。,克服手段： 增加酶的用量 擴大

12、酶催化反應(yīng)的體積，使得潛在抑制因素被稀釋 延長酶催化反應(yīng)的時間,對于DNase的污染，可加入二價金屬離子螯合劑EDTA結(jié)合Mg2+。 加入適量聚陽離子亞精胺有利于限制性內(nèi)切酶對基因組DNA的消化作用。,2. DNA的甲基化程度,采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒 使用對甲基化不敏感的酶,3. 酶切溫度,大部分酶的最適反應(yīng)溫度為37，但也有一些低于或高于此溫度，嚴格參照說明。,4. DNA的分子結(jié)構(gòu),DNA分子的螺旋結(jié)構(gòu)、切割靶序列所處的位置對酶切速率有影響，一些酶對不同部位的限制位點的切割活性也有差異。,5. 酶反應(yīng)的緩沖液,緩沖液成分包括：MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HCl、

13、-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。 各種酶對以上成分的濃度要求都有所差異，若某些酶的敏感因子濃度改變較大可能造成酶的非特異切割。,酶的星號活性： 在非最適條件下，限制性內(nèi)切酶會在與其識別序列類似但并不相同的DNA序列上切割。,表1 具有星反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶與條件 限制酶誘發(fā)星活性的條件a識別序列 AvaI 1, 2, 4 BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC BstI 2, 4 BsuI 2, 4, 6 EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTN Hae 2, 4 HhaI 2, 4, 7 Hind 6 HpaI 1, 2, 4

14、PstI 1, 2, 4, 7 Pvu 2, 4 SalI 1, 2, 4, 7 ScaI 4 - 6, 8 Sst 2, 4 XbaI 2, 4, 7 a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亞砜(8%); 8:無NaCl。,1.7 限制性內(nèi)切酶在實驗中的使用,當建立內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時有幾個關(guān)鍵因素需要考慮。比如如何在正確的反應(yīng)體系中，加入適量的DNA、內(nèi)切酶和緩沖液，就可以獲得最佳酶切效果。,在 50 l體系中，最適反應(yīng)條件下，1 單位（U）的限制性內(nèi)切酶可以在60 分鐘內(nèi)完

15、全切割 1 g 的底物 DNA。,大多數(shù)科研人員會遵循右表中所列的標準反應(yīng)條件，使用 510 倍的過量酶切割DNA，這樣有利于克服由于 DNA 來源不同、質(zhì)量和純度不同而造成的實驗失敗,“標準”反應(yīng)體系, 酶從冰箱取出后請一直置于冰上。 酶最后加入到反應(yīng)體系中。 加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然后在離心機中快速離心。 當切割超螺旋質(zhì)粒和瓊脂糖包埋 DNA 時，通常需要超過 1 unit/g 的酶量以達到完全酶切。,實驗操作注意事項, 建議在 50 l 反應(yīng)體系中消化 1 g 底物 DNA。 為避免星號活性，甘油濃度應(yīng) 5 %。 加入內(nèi)切酶（貯存于 50% 甘油中）

16、的量應(yīng)不超過總體積的 10%。, 大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在 -2 0。只有少數(shù)內(nèi)切酶若貯存時間超過 30 天建議保存在-70。,雙酶切,同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液并避免星號活性是非常重要的一步。,分步酶切應(yīng)從推薦緩沖液鹽濃度低的酶開始，溫育至酶切完畢。調(diào)整緩沖液中鹽濃度（用小體積濃縮鹽溶液）直至滿足第二種酶的要求。加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。也可在第二步酶切反應(yīng)前過柱純化 DNA。,第二節(jié) DNA連接酶,體外連接DNA片段的方法： 用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段 用T4 DNA連接酶直接將平末端DNA片段連接起來，或用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移

17、酶給平末端DNA加上poly(dA)-poly(dT)尾巴后再用DNA連接酶連接 先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端后，在用DNA連接酶連接,1. DNA連接酶,催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵 需要：3-OH、5-P以及NAD+或ATP做能源 不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA必須是雙螺旋DNA分子的一部分,nick,gap,DNA連接的分子機理,連接反應(yīng)的影響因素,1. 連接緩沖液的影響：合適酸堿度，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10

18、mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。,2. ATP濃度的影響：連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，過濃會抑制反應(yīng)。由于ATP極易分解，含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20保存，溶化取用后立即放回。最好小管分裝貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。,4、連接溫度與時間的影響：因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶

19、的最適溫度又恰為37。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16，時間為4-16h。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。,5、載體與插入片段的量 適當?shù)妮d體與片段的摩爾比能提高連接效率，并減少多拷貝插入片段的的形成，一般：,載體,插入片段,=,1,3-10,2. 粘性末端DNA的連接,DNA片段與載體用同一種內(nèi)切酶酶切后，利用DNA連接酶將酶切形成的粘性末端連接起來,單酶切時如何阻止載體的自我環(huán)化？,實驗中普遍采用片段和載體用不同的酶雙酶切形成不同的粘性末端，這種操作具有方向性,3. 平末端DNA的連接,直接用T4 DNA連接酶（需要AT

20、P及高濃度酶）,（1）同聚物加尾法,（2）銜接物連接法,雙銜接物連接法,（3）DNA接頭連接法,練習題,TMTC：too many to count,答案：,第三節(jié) DNA聚合酶,DNA聚合酶能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。,1. DNA聚合酶I,在50年代的中期，A. Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶（DNA polymerase ，DNA pol ）原來稱為Kornberg酶。以后又相續(xù)發(fā)現(xiàn)了DNA pol 和DNA pol 。,DNA聚合酶的共同特點是：,（1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的

21、DNA鏈，必須要有引物提供3 OH； （3）合成的方向都是53； （4）除聚合DNA外還有其它功能。,岡崎片段,1.DNA聚合酶I（polI）,三種酶催活性： 5-3 聚合酶活性 5-3 核酸外切酶活性 3-5 核酸外切酶活性,polI催化合成DNA的三種條件：,（1）存在四種dNTPs和Mg2+ （2）帶有3-OH游離基團的引物鏈 （3）DNA模板（雙鏈或單鏈）,鏈合成方向：5 3,polI的5 3聚合作用,polI的5 3核酸外切酶活性（切除修復(fù)）,必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；切割部位既可以是末端也可以是距末端數(shù)個核苷酸遠的磷酸二酯鍵；伴隨發(fā)生的DNA合成可以增強5-3外切酶的活性；對雙鏈D

22、NA的單鏈缺口有活性但要存在5-P基團。,用枯草桿菌蛋白酶切割成兩個片段，一個片段36kDa具有5-3外切酶的活性;另一片段76kDa具有聚合酶活性及3-5外切酶活性，此即為Klenow片段。,polI的3 5 核酸外切酶活性（校正）,從DNA鏈3-OH末端開始水解DNA并釋放單核苷酸分子，底物可以是雙鏈的DNA也可以是單鏈的DNA。當反應(yīng)物中缺乏dNTPs時，3-5外切酶活性將從3-OH開始降解DNA。但在具有dNTPs的條件下，這種降解活性會被5-3的聚合酶活性所抑制。,DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備放射性標記的DNA探針,PolI、DNaseI、 32P-dNTPs、未標記的dNTPs,2. DN

23、A聚合酶I的Klenow片段,具有5-3聚合酶活性、3-5外切酶活性,用途： （1）修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3隱蔽末端； （2）標記DNA片段的末端； （3）cDNA克隆中的第二鏈cDNA的合成； （4）DNA序列測定,3. T4 DNA聚合酶,兩種酶催活性：5-3聚合酶及3-5外切酶,用來標記DNA平末端或隱蔽的3-末端,4. Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermus aquaticus）yT1株分離提取的。yT是一種嗜熱真菌，能在7075生長。,Taq酶的特點： 耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是

24、原來的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。 70延伸率大于60個核苷酸/秒,Taq DNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而無35外切活性，因而，在pCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯配，該酶沒有校正功能的，30次循環(huán)Taq酶的錯配率約為0.25,應(yīng)用低濃度的dNTP(各20molL)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55的復(fù)性溫度，可提高Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5x10-6次/（

25、核苷酸*循環(huán)）。,Taq 酶的性質(zhì),Taq 酶的性質(zhì),Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性，可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3端加上個堿基，尤其是dATP最容易加上。,用于TA克隆,Taq酶還具有反轉(zhuǎn)錄活性。在2-3mmol/LMg2+濃度下68時出現(xiàn)類似反轉(zhuǎn)錄酶的活性。若有Mg2+存在，則反轉(zhuǎn)錄活性更佳，利用這一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的擴增。,Taq 酶的選擇,高特異性Taq酶,最典型的代表是熱啟動Taq酶,如何減少引物和模板的非特異性配對？,第一代熱啟動Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修飾，比如用抗體抑制，蠟封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-L

26、TI的一些產(chǎn)品。,新一代的熱啟動Taq酶是通過內(nèi)部改造的重組酶，真正實現(xiàn)便利的熱啟動，代表產(chǎn)品如QIAGEN公司的HotStar系列,熱啟動的Taq酶也是實現(xiàn)一步法RT-PCR的基礎(chǔ),高保真Taq酶,經(jīng)基因工程改造，具有3 -5 外切酶活性（校驗功能）,擴增效率降低，不宜用于TA克隆,如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA聚合酶，QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特異性與保真性于一體 。,高耐熱性Taq酶,NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來后克隆的，是普通Taq 酶耐熱性的三倍以上，前者在9

27、5C半衰期近7小時，100C近2小時；后者更甚，分別為23小時和8小時。,超長片段擴增Taq酶,對于作基因組圖譜、測序及分子遺傳學研究的用戶，可能會用到超長片段的擴增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和熱啟動抗體，對復(fù)雜模板可擴增10kb片段，簡單模板可達40kb 。,5. 逆轉(zhuǎn)錄酶,（1） AMV（鳥類骨髓母細胞瘤病毒）反轉(zhuǎn)錄酶,肽鏈：具有反轉(zhuǎn)錄酶與RNaseH活性 （RNaseH：核糖核酸外切酶，以5-3 或3 -5 方向特異地降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈） 肽鏈： 5-3脫氧核酸外切酶 （以RNA-DNA雜交分子為底物）,依賴于RNA的DNA聚合酶,（2） M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒 ）反轉(zhuǎn)錄酶 1) 特點： 不具內(nèi)切酶活性; RNase H活性低; 穩(wěn)定性差 2) 與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較 a合成短鏈cDNA(0.6 kb)時，兩者相同，但M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān) b合成長鏈cDNA(4.5-7.5