鹽析法分離蛋白質(zhì)

1、第4章 鹽析法,知識點(diǎn)：鹽析法，等電點(diǎn)沉淀法，有機(jī)溶劑 沉淀法，選擇性變性沉淀法，金屬離子沉淀法。 重點(diǎn)：上述幾種沉淀方法的概念、原理及其適用范圍；鹽析法的影響因素對沉淀效果的影響，并能根據(jù)實(shí)際情況予以靈活應(yīng)用和選擇。 難點(diǎn)：常用沉淀方法的靈活運(yùn)用。,沉淀定義 沉淀特點(diǎn) 應(yīng)用范圍 沉淀分類,1. 沉淀法概述,鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 選擇性變性沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法 離子型聚合物沉淀法 聚電解質(zhì)沉淀法 高價金屬離子沉淀法,沉淀法分類,活性蛋白 非活性蛋白 理化性質(zhì) 溶解度 提取方法,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)的回顧,鹽析沉淀步驟 加沉淀劑方式 陳化條件 脫鹽處理,2. 鹽析沉淀,鹽析機(jī)理示意圖,鹽離子與蛋白

2、質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降； 鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降； 鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周圍有序排列的水分子的極化，使水活度降低。,鹽析的機(jī)理,Cohn方程式logS=-KsI Ks鹽析 鹽析 二次鹽析,鹽析沉淀基礎(chǔ),圖1 碳氧血紅蛋白的溶解度與硫酸銨離子強(qiáng)度的關(guān)系圖,不同蛋白質(zhì)的溶解度曲線,蛋白質(zhì)的鹽析分布曲線,溶解度曲線(a)和鹽析分布曲線(b),對影響 對Ks影響 鹽種類 鹽濃度 溫度 pH值,鹽析影響因素,無機(jī)鹽種類的影響,圖7 不同鹽溶液中碳氧血紅蛋白的溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系（25

3、）()NaCl; ()KCl; ()MgSO4; ()NH4)SO4; ()Na2SO4; ()K2SO4; ()檸檬酸三鈉,溫度的影響,pH對的影響,蛋白質(zhì)起始濃度的影響,二次鹽析,鹽析操作,3 等電點(diǎn)沉淀實(shí)例,從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI5.3)時，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。 堿性磷酸酯酶的pI沉淀提取：發(fā)酵液調(diào)pH 4.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用pH 9.0的0.1

4、 mol/L Tris-HCl緩沖液重新溶解，加入2040%飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀Tris-HCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。,4 有機(jī)溶劑沉淀原理圖,有機(jī)溶劑沉淀實(shí)例,酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氫二鈉溶液，37水浴保溫2 h，室溫?cái)嚢? h，離心收集上清液，升溫至55，保溫20 min后迅速冷卻離心去除熱變性蛋白，上清液中多為熱穩(wěn)定性較高的醇脫氫酶。,5 選擇性熱變性沉淀實(shí)例,（1）非離子型聚合物沉淀法 （2）聚電解質(zhì)沉淀法 （3）金屬離子沉淀法 （4）親和沉淀,6 其他沉淀法,凝聚技術(shù) 絮凝技術(shù),7 凝聚和絮凝技術(shù),第五章 沉淀法課后練習(xí),名詞解釋： 鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀