附錄3　常用培養(yǎng)基配方.ppt

1、常用培養(yǎng)基配方,一、實驗?zāi)康?掌握在真菌、細菌、放線菌分離培養(yǎng)工作中常用的合成和半合成培養(yǎng)基配制的一般原理、方法、程序、環(huán)節(jié)及要求和注意事項。,實驗內(nèi)容,二、實驗原理,培養(yǎng)基的配制是進行微生物學(xué)實驗工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方組成及配制方法雖各有差異,但一般培養(yǎng)基配制的常規(guī)程序卻大致相同，例如器皿的準備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)。,肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種廣泛用于培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基，屬于半合成培養(yǎng)基。其主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。它們分別提供微生物生長繁

2、殖所需要的碳源、氮源、能源、生長因子和無機鹽等。 培養(yǎng)基都是水溶液，這是因為一切生物細胞都必須要有水的參與。,高氏一號培養(yǎng)基是一種用于培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的可溶性淀粉作為碳源和能源，KNO3作為氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4作為無機鹽等。,馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)酵母菌和霉菌，為半合成培養(yǎng)基。食品檢測國標使用虎紅培養(yǎng)基。,1.培養(yǎng)基的配制過程,1.1液體培養(yǎng)基的配制 1.1.1稱量 一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計算各成分的用量然后進行準確稱量。 染料、指示劑、膽鹽等物質(zhì)何時加入？調(diào)整pH后。 1.1.2溶化 將稱好的藥品置

3、于一燒杯中，先加入少量水，然后加熱溶解，并不斷用玻璃棒攪動。 含銅大于0.3mol/L時，細菌不易生長；含鐵大于0.14mol/L妨礙細菌產(chǎn)生毒素。,1.1.3定容,待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。 問：如某種藥品用量太少如何稱量？ 答：可先配置成較濃溶液，然后按比例吸收一定體積溶液，加入到培養(yǎng)基中。,1.1.4調(diào)PH,一般用pH試紙測定培養(yǎng)基pH。用剪刀剪出一段pH紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀察其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液進行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐漸加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞

4、培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。,注：一般將培養(yǎng)基pH調(diào)整高出所需值的0.1-0.2個pH單位，經(jīng)高壓滅菌后，其pH要降低0.1-0.2個單位。,1.1.5過濾,用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。,1.2固體培養(yǎng)基的配制,配制固體培養(yǎng)基時，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發(fā)而失去的水分。,2.培養(yǎng)基的分裝,根據(jù)不同需要，可將已配好的培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi)，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可

5、用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。,2.1試管的分裝,取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。 注：分裝在不同規(guī)格三角燒瓶、試管等容器中，分裝量不宜超過容器的2/3，否則會溢出。,裝入試管培養(yǎng)基的量，視試管大小及需要而定。若所用試管大小為15*150mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1/4左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面

6、的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1/5，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1/3為宜。,2.2錐形瓶的分裝,用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250ml錐形瓶中加入50ml的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基時，可在250ml錐形瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉（按2%計算）。滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。,3.棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎,為了培養(yǎng)好氧性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內(nèi)空氣先進行過濾，除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。,3.1試管棉塞的制作,制棉塞時，應(yīng)選取用大小，厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔中，用右手食指

7、將棉花從中央壓入圓孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的2/3在試管內(nèi)，1/3在試管外。,將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。,3.2錐形瓶棉塞制作,通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上8層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線捆好，滅菌

8、待用。,4.培養(yǎng)基的滅菌,下一章節(jié)詳述。,5.斜面和平板的制作,5.1斜面的制作 將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱傾斜固定，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。,葡萄糖：乳糖1：9 下黃上不黃 為分解葡萄糖，不分解乳糖 上下均黃 為分解葡萄糖、乳糖 上下均不黃 為非發(fā)酵菌 中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S,5.2平板的制作,將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，冷卻至50攝氏度左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時，皿蓋上冷凝水太多，溫度低于50攝氏度，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)在酒精燈旁進行，左手拿培養(yǎng)皿，右手

9、拿錐形瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼瓶口。用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫。置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿。使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。,三、實驗材料,3.1藥品 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O和FeSO47H2O、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂等。,3.2溶液,1mol/LNaOH、1mol/LHCl。,3.2溶液,天平、高壓蒸汽滅菌器。,3.4玻璃器皿,移液管、試管、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。,3.5其他常用器皿,藥匙、pH試紙、稱量紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。,四、實驗內(nèi)容,

10、4.1肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制 4.1.1培養(yǎng)基成分 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 水 1000ml Ph 7.2,4.1.2配制方法,（1）稱量及融化 分別稱取蛋白胨和NaCl的所需量，置于燒杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸餾水，用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一燒杯中，進行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。倒入上述燒杯中。將燒杯置于石棉網(wǎng)上加熱，用玻璃棒攪拌，使藥品全部融化。,（2）調(diào)Ph 待溶液冷卻至室溫時，用1mol/lNaOH溶液調(diào)pH至7.2。 （3）定容 將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。 （4）加瓊脂 加入所需量的瓊脂，加熱融化，補充

11、失水。 （5）分裝、加塞、包扎。 （6）高壓蒸汽滅菌0.1MPa滅菌20min。,4.2高氏合成一號培養(yǎng)基 4.3馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基,4.4干粉培養(yǎng)基使用注意事項,培養(yǎng)基搖勻后準確稱量； 使用蒸餾水或去離子水配制培養(yǎng)基； 宜用中性玻璃質(zhì)容器，不宜用銅或鐵質(zhì)容器； 加熱溶解時應(yīng)適當攪拌，培養(yǎng)基不能過度加熱； 含瓊脂的培養(yǎng)基高壓滅菌后不能長時間處于高溫狀態(tài)，應(yīng)適當水浴及時使用或迅速冷卻保存。,五、實驗報告內(nèi)容,5.1記錄所配制的培養(yǎng)基的名稱及成分。 5.2分析你配制培養(yǎng)基的碳源、氮源、能源、無機鹽及維生素的來源。,六、思考題,6.1培養(yǎng)細菌一般常用什么培養(yǎng)基？培養(yǎng)放線菌常用什么培養(yǎng)基？培養(yǎng)酵母和霉

12、菌常用什么培養(yǎng)基？現(xiàn)行國家標準培養(yǎng)基。 6.2牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜？ 6.3何謂培養(yǎng)基的自然pH？為什么在配制培養(yǎng)基時經(jīng)常需要調(diào)節(jié)pH？,第三節(jié) 玻璃器皿的包扎,1.培養(yǎng)皿的包扎 培養(yǎng)皿常用牛皮紙或舊報紙包緊，一般以5-8套培養(yǎng)皿包成1包。包好后干熱或濕熱滅菌。或者不用紙包扎，直接放入特制的金屬（不銹鋼或鐵皮）筒內(nèi)，加蓋干熱滅菌。,2.吸管的包扎 在干燥吸管的上端約0.5cm處，塞入一小段1-1.5cm的棉花，目的是避免將外界或嘴中雜菌吹入罐內(nèi)，或不慎將菌液吸出館外。棉花松緊要合適，若過緊，吹吸液體太費力；過松，吹氣時棉花則會下滑。,挑取4-5cm寬的長紙條，將吸管尖端斜放在紙條的一端，與紙約呈30度角，折疊紙條包住尖端，左手握住吸管身，右手將吸管