多糖的提取分離方法

1、1、多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、 動(dòng)物多糖 3大類。 多糖的提取首先要根據(jù)多糖的存在形式及提取部位,決定在提取之前就是否做預(yù)處理。動(dòng)物多糖與微生物多糖多有脂質(zhì)包圍 ,一般需要先加入丙酮、 乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進(jìn)行回流脫脂,釋放多糖。 植物多糖提取時(shí)需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類,在提取前 ,應(yīng)先用低極性的有機(jī)溶劑對原料進(jìn)行脫脂預(yù)處理,目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法、生物提取法、強(qiáng)化提取法等。1.1 溶劑法1.1.1 水提醇沉法水提醇沉法就是提取多糖最常用的一種方法。多糖就是極性大分子化合物,提取時(shí)應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。用水作溶劑來提取多

2、糖時(shí),可以用熱水浸煮提取,也可以用冷水浸提滲濾 ,然后將提取液濃縮后,在濃縮液中加乙醇,使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70 %左右 ,利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì) ,使多糖從提取液中沉淀出來,室溫靜置 5 h,多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與得率均較高。影響多糖提取率的因素有:水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)等。水提醇沉法提取多糖不需特殊設(shè)備,生產(chǎn)工藝成本低 ,安全 ,適合工業(yè)化大生產(chǎn) ,就是一種可取的提取方法。但由于水的極性大,容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來,從而使提取液存放時(shí)腐敗變質(zhì) ,為后續(xù)的分離帶來困難,且該法提取比較耗時(shí),提取率也不高。1.1.2 酸提法為了提高多糖的提取率,在水提醇

3、沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低pH值下難以溶解 ,可用乙酸或鹽酸使提取液成酸性, 再加乙醇使多糖沉淀析出 ,也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出。由于 H的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對較高,但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂,且酸會(huì)對容器造成腐蝕,除弱酸外 ,一般不宜采用。 因此酸提法也存在一定的不足之處。1.1.3 堿提法多糖在堿性溶液中穩(wěn)定 , 堿有利于酸性多糖的浸出 ,可提高多糖的收率 ,縮短提取時(shí)間 ,但提取液中含有其它雜質(zhì) ,使粘度過大 ,過濾困難 ,且浸提液有較濃的堿味 ,溶液顏色呈黃色 ,這樣

4、會(huì)影響成品的風(fēng)味與色澤。1.1.4 超臨界流體萃取法超臨界流體萃取技術(shù)就是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術(shù)。超臨界流體就是指物質(zhì)處于臨界溫度與臨界壓力以上時(shí)的狀態(tài),這種流體兼有液體與氣體的特點(diǎn),密度大 ,粘稠度小 ,有極高的溶解 ,滲透到提取材料的基質(zhì)中 ,發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大,提取結(jié)束后 ,再通過減壓將其釋放出來 ,具有保持有效成分的活性與無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。由于CO2的超臨界條件(TC304.6 ,Tp7.38 MPa)容易達(dá)到 ,常用于超臨界萃取的溶劑 ,在壓力為 8 40 MPa 時(shí)的超臨界 CO2 足以溶解任何非極性、中極性化合物 ,在加入改

5、性劑后則可溶解極性化物。該法的缺點(diǎn)就是設(shè)備復(fù)雜 ,運(yùn)行成本高 ,提取范圍有限。1.2 酶解法1.2.1 單一酶解法單一酶解法指的就是使用一種酶來提取多糖,從而提高提取率的生物技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。蛋白酶對植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用,使其結(jié)構(gòu)變得松散 ;蛋白酶還會(huì)使糖蛋白與蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解,降低它們對原料的結(jié)合力,有利于多糖的浸出。1.2.2 復(fù)合酶解法復(fù)合酶解法采用一定比例的果膠酶、纖維素酶及中性蛋白酶,主要利用纖維素酶與果膠酶水解纖維素與果膠,使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂,釋放細(xì)胞壁內(nèi)的活性多糖,多糖釋放的多少與復(fù)合酶的加入量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解p

6、H 值有直接的關(guān)系。酶解法提取的實(shí)質(zhì)就是通過酶解反應(yīng)強(qiáng)化傳質(zhì)過程。此法具有條件溫與、雜質(zhì)易除與得率高等優(yōu)點(diǎn)。1.3 物理強(qiáng)化法1.3.1 微波輔助提取法微波萃取就是高頻電磁波穿透萃取媒質(zhì),到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部,能迅速轉(zhuǎn)化為熱能使細(xì)胞內(nèi)部溫度快速上升,細(xì)胞內(nèi)部壓力超過細(xì)胞壁承受力,細(xì)胞破裂 ,細(xì)胞內(nèi)有效成分流出,在較低的溫度下溶解于萃取媒質(zhì),通過進(jìn)一步過濾與分離,獲得萃取物料。微波輔助提取多糖與其她的萃取方法比較,微波萃取效率高,操作簡單 ,且不會(huì)引入雜質(zhì),多糖純度高 ,能耗小 ,操作費(fèi)用低 ,符合環(huán)境保護(hù)要求,就是很好的多糖提取方法。1.3.2 超聲波輔助提取法超聲波提取就是利用超聲波的機(jī)械效

7、應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)。機(jī)械效應(yīng)可增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力,能有效的破碎生物細(xì)胞與組織,從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中;空化效應(yīng)使整個(gè)生物體破裂,整個(gè)破裂過程在瞬間完成,有利于有效成分的溶出; 熱效應(yīng)增大了有效成分的溶解速度,這種熱效應(yīng)就是瞬間的,可使被提取成分的生物活性盡量保持不變;此外 ,許多次級效應(yīng)也能促進(jìn)提取材料中有效成分的溶解,提高了提取率。超聲波提取與水煮法醇沉法相比,萃取充分 ,提取時(shí)間短 ;與浸泡法相比 ,提取率高。1.3.3 高壓脈沖法高壓脈沖法就是對兩電極間的流態(tài)物料反復(fù)施加高電壓的短脈沖( 典型為20 80kV/cm)進(jìn)行處理 ,作用機(jī)理有多種假說,如細(xì)胞膜穿孔效應(yīng)、

8、電磁機(jī)制模型、粘彈極性形成模型、電解產(chǎn)物效應(yīng)、臭氧效應(yīng)等,研究最多的就是細(xì)胞膜穿孔效應(yīng)。動(dòng)物、植物、微生物的細(xì)胞,在外加電場作用下,產(chǎn)生橫跨膜電位,絕緣的生物膜由于電場形成了微孔,通透性發(fā)生變化,當(dāng)整個(gè)膜電位達(dá)到極限值(約為1 V)時(shí) ,膜破裂 ,膜結(jié)構(gòu)變成無序狀態(tài),形成細(xì)孔 ,滲透能力增強(qiáng)。電位差達(dá)到臨界點(diǎn),細(xì)胞破裂。2、多糖的分離純化2.1 除蛋白2.1.1Sevage 法根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn),用 V(氯仿 ) V(戊醇或正丁醇)為 5 1 或41,混合物劇烈振搖20 30 min, 蛋白質(zhì)變性生成凝膠,離心分離 ,分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。 此種只能除去少量蛋

9、白質(zhì) ,效率不高 ,須反復(fù)多次較溫與 ,在避免多糖降解上效果較好 ,如配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶,多糖有損失。,用 Sevage但此方法比法效果更佳。此法不能除去脂蛋白,因?yàn)橹鞍兹苡诼确隆?.1.2 三氟三氯乙烷法將多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合水層 ,水層繼續(xù)用上述方法反復(fù)處理幾次溶劑沸點(diǎn)低 ,易揮發(fā) ,不宜大量應(yīng)用。,低溫?cái)嚢?10 min ,得無蛋白質(zhì)的多糖溶液左右 ,離心分離得上層,此法效率較Seavg 法高 ,但2.1.3 三氯乙酸法三氯乙酸就是一種有機(jī)酸,使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機(jī)酸作用而變性沉淀。該法就是在多糖水提液中滴加5 % 10 %與多糖水提取液等體積的三氯乙酸,混勻靜

10、置過夜,離心除去膠狀沉淀 ,重復(fù)以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止,得無蛋白質(zhì)的多糖。三氯乙酸濃度越大 ,除蛋白質(zhì)效果越好,但對多糖的影響也越大,可能就是三氯乙酸對多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用使多糖降解 ,而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強(qiáng)。植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白質(zhì),也可先用蛋白水解酶,使樣品中的蛋白質(zhì)部分降解后再用Sevag 法效果更好 ;微生物多糖去除蛋白常采用Sevag 法、三氟三氯乙烷法;也可用鹽析法、有機(jī)溶劑萃取等方法除蛋白。,2.2 多糖的分離主要有分級沉淀、季銨鹽沉淀法、金屬鹽沉淀法、 色譜分離、膜分離、透析、電滲析等目前大多采用DEAE凝膠或其她各種不同類型的凝膠柱層析

11、以及離子交換色譜法。2.2.1 分級沉淀法大多數(shù)活性多糖可溶于水,3 個(gè)碳以下的多糖還可溶于乙醇,隨著聚合度的增大,多糖在乙醇中的溶解度逐漸降低。根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇,使乙醇的體積濃度逐漸增加到50,100,200,900 mL/L, 從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。,2.2.2 色譜分離法常用兩種色譜分離方法:一就是凝膠柱色譜法,二就是離子交換色譜法。2.2.3 膜分離法膜分離技術(shù) (membrane separation technology,MST) 就是一種高效分離技術(shù) ,分離過程以選擇透過性膜作為分離介質(zhì) ,通過在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)力 (壓力差、化學(xué)位差

12、、電位差等 ),使原料液中組分有選擇性的通過膜。 目前應(yīng)用較多的就是超濾與微濾技術(shù)。3 多糖的分析鑒定3.1 含量的測定測定方法 :硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、 yaphe 法、薄層色譜法、酶法、原子吸收法、HPLC 法、凝膠電泳法、親與電泳法、連續(xù)流動(dòng)分析法檢測法44 、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮硫酸法(總糖 )、DNS 法(還原法)、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對某些多糖的測量效果好。比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法與電泳法等可同時(shí)用于多糖的定性定量分析。3.2 純度鑒定多糖就是高分子化合物定分子量范圍的均一組分。法等。 現(xiàn)在應(yīng)

13、用較多的就是,其純品微觀上就是不均一的,通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上就是一多糖純度鑒定的常用方法:超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPCHLPC 法 ,旋光度測定也就是純度測定的一種方法。3.3 分子量的測定多糖分子量的測定就是研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要工作。常用方法 :滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC 法、 MALDI TOF MS 法。3.4 結(jié)構(gòu)測定3.4.1 多糖一級結(jié)構(gòu)測定多糖的一級結(jié)構(gòu)分析,主要就是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型。常用化學(xué)法與儀器分析法。多糖組分與分子比例測定法: 部分酸解法、完全酶解法、色譜法 ;吡喃、呋喃環(huán)形式結(jié)構(gòu)的分析:紅外光譜 ;連接次序 :選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振 ;異頭異構(gòu)體 :糖苷酶水解、核磁共振 ;羥基被取代情況 :甲基化反應(yīng)、氣相色譜、過碘酸氧化、 Smith 降解法與測硫酸基法(terho法 )、核磁共振、質(zhì)譜法反應(yīng) ;多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多; 糖鏈、肽鏈連接方式:單糖與氨基酸組成、稀堿水解法、肼解,迄今沒有一種方法可以單獨(dú)完成多糖結(jié)構(gòu)的分析。儀器分析與化學(xué)方法相結(jié)合就是常用的多糖結(jié)構(gòu)測定方法。3.4.2 多糖高