西華師范大學(xué)微生物學(xué)課件3(宋波老師).ppt

1、第八章 微生物的遺傳與變異,第一節(jié) 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)及其特性 第二節(jié) 微生物的遺傳物質(zhì) 第三節(jié) 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移和重組 第四節(jié) 微生物的誘變育種和遺傳工程,一、遺傳物質(zhì)的鑒定 二、基因組DNA和染色體 三、染色體以外的遺傳因子,第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ),一、遺傳物質(zhì)的鑒定,證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn),1928年英國人Griffith發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象 1944年very 等人證實(shí)是遺傳物質(zhì) 1953年美國人利用噬菌體證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì) 3 1956美國人H.Fraenkel-Conrat植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)證實(shí)是遺傳物質(zhì),有 莢 膜 菌落光滑 分泌毒素 致 病,無 莢 膜 菌落粗糙 無 毒

2、 不 致 病,SSS三個(gè)血清型,RRR三個(gè)血清型,實(shí)驗(yàn)材料： 肺炎雙球菌,轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn),結(jié)論：加熱殺死的型細(xì)菌，在其細(xì)胞內(nèi)可能存在一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它能以某種方式進(jìn)入型細(xì)胞，并使型細(xì)菌獲得表達(dá)型莢膜性狀的遺傳特性,轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（3）S型菌無細(xì)胞抽提液試驗(yàn),Cncnc-micro,以上實(shí)驗(yàn)說明：加熱殺死的SIII型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入RII型細(xì)胞并使RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細(xì)胞。,噬菌體感染實(shí)驗(yàn),步驟,1：用含同位素35, P32的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌,2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打是S

3、35P32標(biāo)記 3: 讓標(biāo)記的T2感染沒有標(biāo)記的大腸桿菌,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,說明進(jìn)入細(xì)胞的是DNA，是遺傳物質(zhì),沉淀中含 25%放射性,以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn),（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,DNA,說明進(jìn)入細(xì)胞的是DNA，是遺傳物質(zhì),植物病毒蛋白質(zhì)和RNA可以人為地分開, 同時(shí)又可把它們重新組合成具感染性的病毒.,植物病毒的重建實(shí)驗(yàn),原始株 拆開 重建 感染 分離純化,植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

4、,結(jié)論,細(xì)胞生物的遺傳物質(zhì)是DNA或,朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考,朊病毒含有微量的核酸，仍未發(fā)現(xiàn)？ 朊病毒僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成 朊病毒的遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì)？,亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子，迄今為止尚為 發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸。,其致病作用是由于動(dòng)物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)PrP c改變折疊狀態(tài)為 PrP sc所致，而這二種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并沒有改變。,人的庫魯病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔癢癥(scrapie),牛海綿狀腦病(spongiform encephalopathy),引起人與動(dòng)物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,基因是一段DNA,第二節(jié)

5、微生物的遺傳物質(zhì),DNA就是脫氧核糖核酸（長鏈）,腺嘌呤（A）,鳥嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,基因測序就是讀出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.,基因控制Pr因而控制性狀,基因是什么？,Cncnc-micro,基因是生命的密碼。 基因記錄和傳遞遺傳信息。 基因決定生物體的生長、病、老死等一切生命現(xiàn)象。,基因組（genome）：一個(gè)物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱,真核生物和原核生物的遺傳物質(zhì),細(xì)胞質(zhì)基因 2um質(zhì)粒 F因子 R因子 Col質(zhì)粒 毒性質(zhì)粒 降解性質(zhì)粒,遺傳物質(zhì)類型,核染色體 核外染色體(質(zhì)粒),真核生物細(xì)胞核 原核生物核區(qū) 真核生物的 原核生物

6、的,線粒體 葉綠體,與組蛋白相結(jié)合,真核生物的核DNA,核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA和組蛋白(histone)構(gòu)成，由4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4， 每一種組蛋白各二個(gè)分子，形成一個(gè)組蛋白八聚體，約200 bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，形成了一個(gè)核小體,染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；,鏈環(huán)狀的染色體在細(xì)胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式 存在于細(xì)胞中，該小體稱為擬核(nucliod)，其上結(jié)合有類組蛋白蛋 白質(zhì),原核生物的染色體,性質(zhì)：質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的 存在方式：游離態(tài)或附加體 重組：質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也

7、可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。 功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、降解功能等。,一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。,原核生物的質(zhì)粒,在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢。,類型： 嚴(yán)緊型 松弛型,質(zhì)粒所編碼 的功能和賦 予宿主的表 型效應(yīng),致育因子（Fertility factor，F(xiàn)因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性質(zhì)粒（virulenc

8、e plasmid） 代謝質(zhì)粒（Metabolic plasmid）,質(zhì)粒的主要類型,1、致育因子(Fertility factor，F(xiàn)因子),又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌 的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。,攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株 （相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的 菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌性）。,質(zhì)粒的常見類型,存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、等細(xì)菌中，決定性別。,2、抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。,抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌 產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。,質(zhì)粒的主要類型,抗性轉(zhuǎn)移因

9、子,抗性決定子,R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對 下列藥物及重金屬具有抗性： 汞（mercuric ion ，mer） 四環(huán)素（tetracycline，tet ） 鏈霉素(Streptomycin, Str)、 磺胺(Sulfonamide, Su)、 氯霉素(Chlorampenicol, Cm) 夫西地酸（fusidic acid，fus） 并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是 成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。,3、Col的質(zhì)粒（Col plasmid）,大腸桿菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。,質(zhì)粒的主要類型,編碼大腸桿菌（E. coli）產(chǎn)生的大桿菌素為（colicins），的質(zhì)粒。,產(chǎn)毒素大腸桿

10、菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一， 其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。,4、毒性質(zhì)粒（virulence plasmid）,許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒 具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動(dòng)物、植物）造成傷害。,蘇云金桿菌含有編碼內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒,根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的 致病因子,質(zhì)粒的主要類型,5、代謝質(zhì)粒（Metabolic plasmid）,質(zhì)粒上攜帶有分解多種特殊有機(jī)化合物能力的因子。,將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用 的簡單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。,假單胞菌： 具有降解一些有毒化合

11、物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥 (2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟腦等的能力。,質(zhì)粒的主要類型,第三節(jié)細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移和重組,接合 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 原生質(zhì)體融合,野生型：從自然界中分離到的沒有發(fā)生任何突變的微生物。能在基本培養(yǎng)基中生長，如以A和B兩個(gè)基因表示這兩種物質(zhì)的合成能力。遺傳型A+B+ 突變型：野生型突變之后，喪失了合成某物質(zhì)的能力。不能在基本培養(yǎng)基上生長，只能生長在完全培養(yǎng)基上，如以A和B兩個(gè)基因表示其喪失這兩種物質(zhì)的合成能力。遺傳型A-B-,根據(jù)微生物對生長因子的需要存在差異，可分為：,所含的營養(yǎng)物質(zhì)能滿足一般微生物生長繁殖所需的氮源、 碳源和無機(jī)鹽

12、等。(基礎(chǔ)培養(yǎng)基),（一）接合（conjugation）,通過接合而獲得新性狀的受體細(xì)胞就是接合子conjugant 研究方法：1946年J.Lederberg等采用E.coli的兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為以后的微生物遺傳學(xué)提供了必要的條件。,定義：通過細(xì)胞間的直接接觸能進(jìn)行大段的轉(zhuǎn)移的過程，叫接合,1946年用E.coli的兩個(gè)營養(yǎng)缺陷型所作的實(shí)驗(yàn)：,1、接合及其發(fā)現(xiàn),A,B,供體菌 受體菌,F因子的分子量通常為5107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛 （sex pili）及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。,接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo),含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面

13、有性菌毛,不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性菌毛,2. 機(jī)制,接合的具體過程,F因子的四種細(xì)胞形式,a）F-菌株， 不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過 接合作用接收 F因子而變成雄性菌株（F+）；,b）F+菌株， F因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)， 形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F因 子。 細(xì)胞表面同樣有性菌毛。,F菌株 和F因子,可逆的,F+（“雄性”）菌株與F 相接觸時(shí)，可通過性菌毛將F因子轉(zhuǎn)移到F 細(xì)胞中，使之也變成F+菌株。

14、 F因子以很高的頻率傳遞，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般并不被轉(zhuǎn)移。,接合的幾種雜交結(jié)果,1 F+ F,2 Hfr F,Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。該菌株與F 接合后的重組頻率比F+ 菌株高幾百倍而得名,Hfr (high frequency recombination)高頻重組菌株,1. Hfr染色體雙鏈中的一條單鏈在F因子處發(fā)生斷裂，F(xiàn)因子位于環(huán)狀單鏈DNA的兩端，F(xiàn)因子的頭先進(jìn)入受體細(xì)胞，然后是細(xì)菌核染色體組，只有細(xì)菌核染色體組完全進(jìn)入受體細(xì)胞之后，F(xiàn)因子的尾才

15、能進(jìn)入受體菌細(xì)胞，完成DNA的傳遞。 在沒有外界干擾的情況下，全部轉(zhuǎn)移過程的完成需要約120分鐘。 2. 由于種種原因DNA轉(zhuǎn)移過程常會(huì)發(fā)生中斷，所以越是前端的基因進(jìn)入F 細(xì)胞的機(jī)會(huì)越大。F因子位于線狀DNA的末端，進(jìn)入受體細(xì)胞的機(jī)會(huì)最小，故這種接合引起轉(zhuǎn)性的頻率最低，但可以出現(xiàn)各種重組子。,接合過程:,接合中斷試驗(yàn)與染色體圖：,接合中斷試驗(yàn)：由Wollman和Jacob首創(chuàng)（1955），首先認(rèn)識了原核微生物染色體的環(huán)狀特性。 原理：接合試驗(yàn)的DNA轉(zhuǎn)移過程存在著嚴(yán)格的順序性，在接合進(jìn)行中采用定時(shí)人為中斷的方法，可以獲得呈現(xiàn)不同數(shù)量 Hfr 性狀的 F 接合子，最后，根據(jù)F中出現(xiàn)Hfr菌株中各

16、種形狀的時(shí)間順序（分鐘），可以繪出較為完整的環(huán)狀染色體圖（chromosome map）。,a,b,c,d,e,利用HfrF-的接合過程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以 分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為 單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。,3 F F-,F+ F,FF-與F+F-的不同：給體的 部分染色體基因隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,R型活菌+S型死菌 S型活菌 定義：受體菌直接攝取來自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。 有關(guān)名詞： 受體菌：recipient/receptor，

17、轉(zhuǎn)化基因的接受者 供體菌：donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者 轉(zhuǎn)化因子：來自供體菌的DNA片段 轉(zhuǎn)化子：transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子,（二）轉(zhuǎn)化（transformation）,1、轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)：,受體細(xì)胞要處于感受態(tài). 感受態(tài)：competence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài).只有處于感受態(tài)的細(xì)菌才能接受轉(zhuǎn)化因子，從出現(xiàn)到消失約為分鐘(對數(shù)期的中期),2、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件：,感覺態(tài)出現(xiàn)原因,細(xì)菌失去部分細(xì)胞壁的結(jié)果 細(xì)菌在細(xì)胞表面產(chǎn)生某種酶引起,感受態(tài)的決定因素,細(xì)胞遺傳性決定 和菌齡有關(guān) 環(huán)腺苷酸CAMP可提高10000 倍 C

18、a2+能促使細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài),感受態(tài)因子,是受體細(xì)胞表面上的一種蛋白質(zhì) 功能使轉(zhuǎn)化因子結(jié)合在受體細(xì)胞表面,供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1 107 D 左右 菌株間的親緣關(guān)系密切,降解,吸附,切割成45106,單鏈入胞,同源部分配對、整合,復(fù)制分裂，只有一個(gè)子代DNA分子獲得供體基因,感受態(tài)細(xì)胞的建立 DNA的結(jié)合和攝取 轉(zhuǎn)化子和染色體重組,3轉(zhuǎn)化的過程,轉(zhuǎn)化的機(jī)理,1 外源DNA在DNA結(jié)合蛋白的幫助下與受體細(xì)胞相結(jié)合 2外源DNA被感受態(tài)細(xì)胞膜上的核酸酶降解成小分子DNA,并進(jìn)一步降解小分子DNA的其中的一條鏈 3 沒有被降解的DNA與感受態(tài)細(xì)胞上的感受態(tài)特異蛋白的作用下,

19、進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi) 4 整合,轉(zhuǎn) 化 中 基 因 交 換 過 程 示 意 圖,4 轉(zhuǎn)化的特點(diǎn),不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，供體 DNA提取出來，注入受體即可。,5、轉(zhuǎn)化的類型：,根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為： 自然遺傳轉(zhuǎn)化natural genetic transformation 人工轉(zhuǎn)化artificial transformation,能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的菌屬主要有： 嗜血桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、假單胞菌中多見。 在放線菌和藍(lán)細(xì)菌以及粗糙脈胞菌和黑曲霉兩個(gè)菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。,自然轉(zhuǎn)化的普遍性：,人工轉(zhuǎn)化,人工轉(zhuǎn)化是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA

20、的能力，或人工地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 方法： CaCl2處理細(xì)胞，使其成為能攝取外源DNA的感受態(tài)狀態(tài). 電穿孔法electroporation：用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜，或擊成小孔，使各種大分子（包括DNA ）能通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。,冰浴10min,三.轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,定義：以溫和噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞的DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,混合培養(yǎng),A,J.Lederberg等（1952）在Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。,1.轉(zhuǎn)導(dǎo)及其

21、發(fā)現(xiàn),色氨酸缺陷型,色氨酸野生型,2.轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類,完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),2.1 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,定義：通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何DNA小片段的“誤包”而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 1952年發(fā)現(xiàn)，在Salmonella typhimurium中存在轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。： 以其野生型菌株作為供體菌 營養(yǎng)缺陷型菌株作為受體菌 P22噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，對供體菌是烈性噬菌體，對受體菌是溫和噬菌體,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo),完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),沒有形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子,普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程,1 噬菌體浸染供體菌 2噬

22、菌體發(fā)生增殖,同時(shí)把供體菌的部分DNA降解成許多小片段 3 包裝,發(fā)生錯(cuò)誤包裝(噬菌體中的DNA全是供體菌的DNA,完全缺陷型) 4完全缺陷型侵染受體菌,將供體菌的基因整合進(jìn)受體菌,2.2 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),特點(diǎn)： 噬菌體對供體菌和受體菌都是溫和噬菌體 只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因（一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因） 缺陷噬菌體是由于其在形成過程中所發(fā)生的低頻率（約10 5）“誤切”，或由于雙重溶源菌的裂解而形成（約形成50%缺陷噬菌體） 分類：低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)與高頻轉(zhuǎn)導(dǎo),定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定 基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,部分缺陷的噬菌體,前噬菌體,脫落,復(fù)制,部分

23、缺陷的噬菌體,局限性低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程,低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）裂解物的形成,局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制-”雜種形成模型”,在轉(zhuǎn)導(dǎo)中，從宿主染色體上切離時(shí)發(fā)生不正常切離的頻率極低，故這種裂解物中的部分缺陷噬菌體的比例是極低的（10 6）。 用LFT裂解物感染宿主，可獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，即低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。 特點(diǎn):誘導(dǎo)的一般都是溶源菌(供體菌),低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT，low frequency transduction）,特點(diǎn):誘導(dǎo)的是雙重溶源菌 與dgal(含有供體菌gal基因的部分缺陷噬菌體)同時(shí)整合在一個(gè)受體菌的核染色體組上, 成為一個(gè)雙重溶源菌（double lysogen）。 當(dāng)被紫外線等誘導(dǎo)時(shí),正常噬菌體的基因

24、可補(bǔ)償dgal缺失的部分基因功能,兩種噬菌體就同時(shí)獲得復(fù)制的機(jī)會(huì).所以在雙重溶源菌中的正常噬菌體被稱為助體（或輔助）噬菌體（helper phage） 雙重溶源菌的裂解物中含有等量的和dgal粒子,稱為HFT（高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)）裂解物。,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT，high frequency transduction）,部分缺陷的噬菌體,前噬菌體,脫落,復(fù)制,部分缺陷的噬菌體,局限性低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程,雙重溶源菌: 含 噬菌體和dgal部分缺陷體,含有供體gal+基因,噬菌體正常脫落,裂解,釋放,形成噬菌斑,轉(zhuǎn)導(dǎo)子,雙重容源菌 【E.coliK12(/dg)】,轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體（ dg） + 輔助噬菌體（ ）,轉(zhuǎn)導(dǎo)子菌

25、落,噬菌斑,U.V.,附,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較,Conjugation,Transformation,Transduction,原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）,概念： 將雙親株的微生物細(xì)胞分別通過酶解去壁，形成原生質(zhì)體，然后在高滲條件下混合，并加入物理的、化學(xué)的或生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集和融合的過程,可以提高重組率 可進(jìn)行多親本融合 有利于不同種間、屬間微生物的雜交 通過原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)量,原生質(zhì)體融合的優(yōu)點(diǎn)：,原生質(zhì)體融合技術(shù)的理論與應(yīng)用價(jià)值,打破了微生物的種屬界限，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組 用于改良菌種特性、提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、使菌種

26、獲得新的性狀、合成新的產(chǎn)物等 可用來探索重大理論問題，研究外源DNA轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及核與核、核與質(zhì)之間的關(guān)系,原生質(zhì)體融合技術(shù)及育種步驟,原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體融合 融合子的檢出與鑒定,原生質(zhì)體融合操作示意圖,去壁 A+B- （高滲下） A+B- PEG或電脈沖 離心促融 去壁 A-B+ （高滲下） A-B+ 融合子（AA, BB, AB）長成菌落 -檢出A+ B+融合子 篩選優(yōu)良性狀的融合子,甲 乙,有性生殖 異核現(xiàn)象 準(zhǔn)性生殖,二、真核微生物的基因重組,一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。 凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，都能采用有性雜

27、交方法進(jìn)行育種。,（一）有性雜交,質(zhì)配,核配,先有絲分裂 再減數(shù)分裂,子囊孢子的繁殖,（二）異核現(xiàn)象,概念：在一些真菌菌絲體的菌絲細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)以上不同遺傳型細(xì)胞核的現(xiàn)象 原因：基因突變或不同遺傳型菌絲之間的聯(lián)合，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,(三）準(zhǔn)性生殖,準(zhǔn)性生殖的概念：,不產(chǎn)生有性孢子的絲狀真菌，不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導(dǎo)致染色體單元化和基因重組的過程。 1953年發(fā)現(xiàn),準(zhǔn)性生殖與有性生殖的不同,重組體細(xì)胞和營養(yǎng)體細(xì)胞相同，不產(chǎn)生特殊的囊器 染色體的交換及單倍體化過程沒有規(guī)律,準(zhǔn)性生殖的過程,異核體的形成 核融合和雜合二倍體的形成 單倍體化,菌絲聯(lián)結(jié) 異核體形成（質(zhì)配） 核配形成雜合二倍體 體細(xì)胞交

28、換和單倍體化。,體細(xì)胞交換和單倍體化,雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離導(dǎo)致個(gè)別染色體減半，直到最后形成單倍體的過程，而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子,A,B,A+B,（同核體）,（異核體）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（雜合二倍體）,單倍體雜合子,突變（ mutation ）：指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。 染色體畸變細(xì)胞學(xué)上可以看到染色體的變化 突變 基因突變細(xì)胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變化 野生型（wild type）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株 突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株,第五

29、節(jié) 微 生 物 的 突 變,(一)幾個(gè)概念,定義：每個(gè)細(xì)胞在每一世代中發(fā)生突變的幾率。 突變率為108是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生一次突變。 突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。 如一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2108個(gè)細(xì)胞時(shí)，如果發(fā)生一次突變的突變率也是108 。 突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù),（二）突變率,（三）突變的特點(diǎn),適用于整個(gè)生物界,以細(xì)菌的抗藥性為例子 不對應(yīng)性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。 自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。 稀有性：突變率低且穩(wěn)定,一般為10-6-10-

30、9。 獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響。 可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。 穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。 可逆性：野生型基因到變異株的突變稱為正向突變（forward mutation），突變株回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變或回變（back mutation或reverse mutation）。,（四）基因突變的自發(fā)性和不對應(yīng)性的證明,在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)對這種抗性產(chǎn)生的原因爭論十分激烈。 一種觀點(diǎn)認(rèn)為：突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的，(比如某種細(xì)菌從對藥物敏感到產(chǎn)生抗性是由于藥物長期作用的結(jié)果)突變的原因和突變的性狀間是相對應(yīng)的。 另一種看法則認(rèn)為：基因突變是

31、自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。 。,證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系！,如何證明基因突變的非對應(yīng)性？,三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn),變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)證據(jù),(在同一個(gè)大管中作整體培養(yǎng)),3 7 1 4 4 3 5,抗噬菌體菌落數(shù) 抗噬菌體菌落數(shù),變量試驗(yàn),甲管,乙管,突變發(fā)生在接觸噬菌體之前，因?yàn)橥蛔兟蕵O低，先分散后培養(yǎng)，在培養(yǎng)中發(fā)生突變的時(shí)間不同，突變細(xì)胞繁殖的代數(shù)也不同各皿的突變細(xì)胞數(shù)量就有很大差異了；而先培養(yǎng)后分散，突變細(xì)胞繁殖的后代均勻 突變發(fā)生在接觸噬菌體之后則無論先分散還是后分散，突變的頻率都應(yīng)相同，平板上的抗性菌落數(shù)目應(yīng)基本一致；,2 涂布試驗(yàn),接觸噬菌體之前,抗性突

32、變已經(jīng)出現(xiàn)并分裂數(shù)次,重新涂布會(huì)把它們分散開各自成菌落. 說明抗性突變是發(fā)生在未接觸噬菌體之前的,涂布試驗(yàn),平板影印培養(yǎng)法,使一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的培養(yǎng)方法,影印培養(yǎng)試驗(yàn),(五) 自發(fā)突變,定義:微生物自然發(fā)生的突變,一般發(fā)生頻率為10-9-10-6,引發(fā)原因: DNA復(fù)制 微生物自身產(chǎn)生誘變物質(zhì) 環(huán)境對微生物的誘變作用,應(yīng)用: 1從生產(chǎn)中選育優(yōu)良突變菌株 2定向育種優(yōu)良品種:在某一特定條件下,長期培養(yǎng)某一微生物菌群，通過不斷轉(zhuǎn)接傳代以積累其自發(fā)突變,并最終獲得優(yōu)良菌株的過程 舉例：卡介苗 特點(diǎn):由于自發(fā)突變率低,緩慢,(六)誘發(fā)突變,定義:通過誘變劑的誘導(dǎo)作用來加快突變的過

33、程 誘變劑:,物理誘變劑：紫外線,激光；X射線,射線和快中子等。 化學(xué)誘變劑：主要有烷化劑,堿基類似物和丫啶類化合物。 由于一切生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)都是核酸尤其是DNA，所以任何能改變核酸結(jié)構(gòu)的因素都可引起突變。,紫外線誘變作用機(jī)理,可使鏈裂斷，破壞核糖和磷酸間的鍵聯(lián) 引起胞嘧啶和尿嘧啶產(chǎn)生水合作用造成氫鍵斷裂 能使胸腺嘧啶成二聚體，使結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,光復(fù)活作用 把經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用,由DNA光解酶(photolyase)完成： 此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價(jià)結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光； 結(jié)合后如受

34、300600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。,光修復(fù),在進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下進(jìn)行照射及處理照射后的菌液。,化學(xué)誘變劑,亞硝酸,堿 基 的 置 換,堿基類似物：5-溴尿嘧啶（胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)類似物）、2-氨基嘌呤（腺嘌呤類似物）在DNA復(fù)制過程中能夠整合進(jìn)DNA分子，因此產(chǎn)生異構(gòu)體頻率高，出現(xiàn)堿基錯(cuò)配頻率也高，從而提高突變頻率。,5溴尿嘧啶（酮式）,5溴尿嘧啶（烯醇式）,間接引起置換的誘變劑,堿基的置 換,堿基的置換,移碼突變,DNA分子中缺失或增加少數(shù)幾個(gè)堿基對而引起,造成突變點(diǎn)以后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)釋

35、發(fā)生錯(cuò)誤,增添一個(gè)堿基,缺少一個(gè)堿基,誘變劑與致癌物質(zhì)的檢測 Ames試驗(yàn),a）利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進(jìn)行誘變育種；,）危害人類自身的健康,如致癌等,很多種化學(xué)物質(zhì)，能以各種機(jī)制導(dǎo)致DNA的突變,b,人和細(xì)菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑也會(huì)作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良后果?；瘜W(xué)藥劑對細(xì)菌的誘變率與其對動(dòng)物的致癌性成正比,發(fā)明人:美國加利福尼亞大學(xué)的Bruce Ames教授于1966年發(fā)明， 因此稱為Ames試驗(yàn),回復(fù)突變(reverse mutation或back mutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變

36、得到恢復(fù)，第二次突變稱為回復(fù)突變,Ames試驗(yàn),Ames試驗(yàn)方法原理： 鼠傷寒沙門氏菌的突變型（his-）菌株在無組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長，在有組氨酸的培養(yǎng)基上可以生長。 但如在無組氨酸的培養(yǎng)基中有致突變物存在時(shí)，則沙門氏菌突變型可回復(fù)突變?yōu)橐吧停ū憩F(xiàn)），因而在無組氨酸培養(yǎng)基上也能生長。his- his+ 故可根據(jù)菌落形成數(shù)量，檢查受試物是否為致突變物。 某些致突變物需要代謝活化后才能使沙門氏菌突變型產(chǎn)生回復(fù)突變，代謝活化系統(tǒng)多用鼠肝勻漿液,The Ames Test for Chemical Carcinogens,具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)

37、 組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率,對照實(shí)驗(yàn),檢測實(shí)驗(yàn),利用回變檢測致癌劑 艾姆斯試驗(yàn)法,培養(yǎng)基中含有微量的組氨酸，經(jīng)培養(yǎng)后，如在平板上無大量菌落產(chǎn)生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片生長大量菌落，說明誘變劑具有致突變作用,突變株 的表型,選擇性 突變株,非選擇性 突變株,營養(yǎng)缺陷型（株） 抗性缺陷型（株） 條件致死突變型（株）,形態(tài)突變型（株） 抗原突變型（株） 產(chǎn)量突變型（株）,按方法分：按突變株的表型是否能在選擇性培養(yǎng)基 上加以鑒別來區(qū)分。,七 突變株的類型,按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細(xì)胞來分： 選擇性突變株（selective mutant）：具有選擇標(biāo)記（如營養(yǎng)

38、缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。 非選擇性突變株（non-selective mutant）：無選擇標(biāo)記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。,形態(tài)突變型 營養(yǎng)缺陷型因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。 抗性突變型因突變而產(chǎn)生了對某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性 條件致死突變型突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型,誘變育種:是用誘變劑使微生物的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)

39、構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的育種方法。,誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。,第六節(jié)微生物遺傳變異的應(yīng)用,一誘變育種,效價(jià)：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1 單位,從 青 霉 素 產(chǎn) 量 看 誘 變 育 種,誘變育種的基本過程：,選擇合適的出發(fā)菌株 制備待處理的菌懸液 誘變處理 篩選 保藏和擴(kuò)大試驗(yàn),出發(fā)菌株用來育種處理的起始菌株出發(fā)菌株應(yīng)具備： 對誘變劑的敏感性高； 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； 出發(fā)菌株的來源； 自然界直接分離到的野生型菌株： 歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌

40、株： 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：,1.出發(fā)菌株的選擇：,(一) 基本原則和過程,2 處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液,芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢 放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子 細(xì)菌指數(shù)期，放線菌霉菌要稍加萌發(fā)后使用 出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸夜,3.誘變處理： 誘變劑的選擇： 提高突變的頻率 擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 使產(chǎn)量變異朝著正突變移動(dòng) 誘變劑量的選擇：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 誘變劑的致死率是30%-80%,選用最適劑量,劑量以誘變劑濃度和處理時(shí)間來表示,合適劑量：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅

41、度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。,經(jīng)培養(yǎng)后，出現(xiàn)三種情況：如在平板上無大量菌落產(chǎn)生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片周圍有一抑制圈，其外才是大量菌落，說明試樣中某誘變劑的濃度很高；如在紙片周圍即生長大量菌落，說明誘變劑的濃度合適。,4. 菌種篩選,篩選方案： 為了提高篩選效率，將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步。 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 復(fù)篩的目的：確認(rèn)符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。,篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.,誘變育種的基本環(huán)節(jié),Cncnc-micro,以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下：,突變株的篩選方法,高產(chǎn)突變菌株的篩選方法,抗性突變體的篩選方法,營養(yǎng)缺陷型的的篩選方法,Cncnc-micro,與突變株的篩選相關(guān)的幾個(gè)概念,與突變株的篩選相關(guān)的幾