微生物限度檢查驗(yàn)證方案

1、微生物限度檢查驗(yàn)證方案起草人起草日期 年 月 日驗(yàn)證小組成員會(huì)簽 日期： 年 月 日批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期 年 月 日目 錄1. 適用范圍2. 驗(yàn)證目的3. 職責(zé)4. 驗(yàn)證所需材料及儀器4.1. 驗(yàn)證所需儀器4.2. 驗(yàn)證所需材料5. 可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)6. 實(shí)驗(yàn)方法6.1. 細(xì)菌、霉菌及酵母菌驗(yàn)證6.2. 控制菌驗(yàn)證7. 驗(yàn)證評(píng)審及報(bào)告8. 再驗(yàn)證周期9. 附件1. 適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。2. 驗(yàn)證目的通過驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測(cè)定。3. 職責(zé)姓名部門職責(zé)4. 驗(yàn)證所需材料及儀器4.1 驗(yàn)證所需儀器SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHP-36

2、0S電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ.SG41.280A手提式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)、培養(yǎng)皿。4.2 驗(yàn)證所需材料 大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。 大腸埃細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株；黑曲霉菌為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株。 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株穿戴次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株

3、的生物學(xué)特性。5. 可接受的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)5.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌；若任一次試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。5.2 控制菌驗(yàn)證 若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌（檢出試驗(yàn)菌判斷如下），按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行 供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活 性，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。5.2.1 大腸埃細(xì)菌檢查結(jié)果判斷 如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供

4、試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h。瓊脂判供試品檢出大腸埃希菌；若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判定供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤

5、麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)6. 實(shí)驗(yàn)方法6.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌驗(yàn)證6.1.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，使菌數(shù)約為50100cfu/ml。 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)2448小時(shí)，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，使菌數(shù)約為50100cfu/ml。6.1.2

6、供試液制備 取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲(chǔ)備液。6.1.3 驗(yàn)證方法6.1.3.1 菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，采用平皿法。 取試驗(yàn)用的1ml菌液（約50100cfu）分別注入平皿，立即傾入培養(yǎng)基。每株試驗(yàn)平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。6.1.3.2 試驗(yàn)組：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液和50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿，立即傾入培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿。6.1.3.3 供試品對(duì)照組：取供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）6.1.3.4 回收率計(jì)算 試驗(yàn)組的菌回收率=試驗(yàn)組平均菌落

7、數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)6.2 控制菌驗(yàn)證菌液組平均菌落6.2.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，使細(xì)菌數(shù)約為10100cfu/ml。6.2.2 供試液的制備 取供試品10g，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，振搖，使呈1：10的供試品儲(chǔ)備液。6.2.3 驗(yàn)證方法6.2.3.1 試驗(yàn)組 大腸埃希菌 分別取供試液10ml，加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，重復(fù)2份，其中1份加入大腸埃希菌10100個(gè)作陽性對(duì)照，另取與供試液

8、等量的稀釋劑加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中作陰性對(duì)照，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取上述增菌液0.2ml，加入含5ml的4-甲基傘形酮葡糖苷培養(yǎng)基（MUG）試管中，置3537培養(yǎng)524小時(shí)，觀察結(jié)果。6.2.3.2 陰性菌對(duì)照組 驗(yàn)證大腸埃希菌 采用革蘭氏陽性球菌金黃色葡萄球菌，取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml，按試驗(yàn)組同法操作，加入金黃色葡萄球菌10100個(gè)作陰性對(duì)照，3537培養(yǎng)1824小時(shí)，取上述增菌液0.2ml，加入含5ml的4-甲基傘形酮葡糖苷培養(yǎng)基（MUG）試管中，置3537培養(yǎng)524小時(shí)，觀察結(jié)果。7. 驗(yàn)證評(píng)審及報(bào)告各階段確認(rèn)完成后，化驗(yàn)室將結(jié)果匯總。以技術(shù)報(bào)告的形式匯總驗(yàn)證結(jié)果，連同

9、微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程報(bào)驗(yàn)證小組審核。驗(yàn)證小組負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證報(bào)告，發(fā)放驗(yàn)證證書(附件1.)，確認(rèn)微生物限度檢查驗(yàn)證周期，對(duì)驗(yàn)證結(jié)果評(píng)審應(yīng)包括：檢查主要的驗(yàn)證試驗(yàn)是否按計(jì)劃完成；（1）檢查驗(yàn)證方案在實(shí)施過程中有無修改；修改的理由是否明確并有批準(zhǔn)手續(xù)；（2）重要試驗(yàn)結(jié)果的記錄是否完整；（3）驗(yàn)證結(jié)果是否符合設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)偏差的結(jié)果有否做過調(diào)整，是否有適當(dāng)?shù)慕忉尣@批準(zhǔn)。（4）驗(yàn)證試驗(yàn)有否遺漏；（5）是否需要作進(jìn)一步的補(bǔ)充試驗(yàn)等。8. 再驗(yàn)證周期質(zhì)量管理部根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果確定設(shè)備再驗(yàn)證周期。9. 附件附件1驗(yàn)證方案修改申請(qǐng)及批準(zhǔn)書驗(yàn)證方案名 稱驗(yàn)證方案編 號(hào)修改內(nèi)容修改原因及依據(jù)修改后方案起草人 部門負(fù)責(zé)人 年 月 日驗(yàn)證小組審 批審核： 年 月 日審核： 年 月 日組長(zhǎng)： 年 月 日附件2.驗(yàn)證證書驗(yàn)證證書 設(shè)備名稱： 設(shè)備編號(hào)： 型 號(hào)： 微生物限度檢查已按驗(yàn)證方案進(jìn)行驗(yàn)證，各項(xiàng)