DNA重組生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告講解

1、DNA重組生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：_生命科學(xué)導(dǎo)論實(shí)驗(yàn)課_ 指導(dǎo)老師：_成績：_實(shí)驗(yàn)名稱：_基因工程實(shí)驗(yàn)_ 實(shí)驗(yàn)類型：_生物實(shí)驗(yàn)_同組學(xué)生姓名：_一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠡蚬こ虒?shí)驗(yàn)是生物實(shí)驗(yàn)中極具代表性的一部分，在此次實(shí)驗(yàn)中有如下目的和要求：1、 通過本實(shí)驗(yàn)了解和掌握含GFP基因質(zhì)粒的提取和瓊脂糖DNA電泳的等十個(gè)小實(shí)驗(yàn)組合而成的基因工程實(shí)驗(yàn)的原理和技術(shù)。2、 了解生物實(shí)驗(yàn)的完整流程，對實(shí)驗(yàn)室基本操作規(guī)范與儀器設(shè)備使用方法得到初步了解，從而建立系統(tǒng)、有條理的實(shí)驗(yàn)思路。3、 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力，在實(shí)踐中加強(qiáng)對專業(yè)知識(shí)的認(rèn)知與體會(huì)，融匯貫通，寓學(xué)于用，感受生物學(xué)科的魅力。二、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理基因工程又稱D

2、NA重組技術(shù)，是將不同來源的基因按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建成雜種DNA分子（又稱重組DNA分子），然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種和生產(chǎn)新產(chǎn)品等?；蚬こ碳夹g(shù)為生命科學(xué)的研究提供了有力的手段，同時(shí)為以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的建立奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)?；蚬こ碳夹g(shù)建立的標(biāo)志性實(shí)驗(yàn)是：1972年，美國斯坦福大學(xué)的伯格(P.Berg)等人將猿猴病毒SV40的DNA和大腸桿菌噬菌體DNA分別進(jìn)行EcoRI酶切，然后用T4DNA連接酶將兩個(gè)酶切片段進(jìn)行連接，率先完成了人類歷史上第一個(gè)DNA分子的體外重組實(shí)驗(yàn)，因此榮獲了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1973年，美國斯坦福大學(xué)

3、的科恩（S.Cohen）等人在體外構(gòu)建了含四環(huán)素和鏈霉素兩個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌中，獲得了雙抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，成功完成了第一個(gè)基因克隆實(shí)驗(yàn)。上述兩大科研成果標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。一個(gè)典型的基因工程技術(shù)包含以下幾個(gè)步驟：1. 目的基因和載體DNA的獲取。2. 目的基因和載體DNA的限制性內(nèi)切酶的酶切消化。3. 酶切后的目的基因和載體DNA的體外重組連接，以獲得重組DNA分子。4. 通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化等技術(shù)，將重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌等活細(xì)胞。5. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選鑒定以及目的基因表達(dá)的檢測。其中目的基因、載體、工具酶及宿主細(xì)胞是缺一不可的，因此被稱為基因工程的四大要素。實(shí)驗(yàn)一 含

4、GFP基因質(zhì)粒的提取目前獲取目的基因DNA片段常用方法是：從Gene Bank中查得目的基因的DNA序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法擴(kuò)增目的基因的DNA片段。根據(jù)目的基因的來源不同，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA，大致有兩個(gè)來源：由于真核細(xì)胞DNA的基因編排方式，是由內(nèi)含子和外顯子等組成，因此，只能通過提取目的基因的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成出cDNA，作為PCR的模板。原核生物的DNA其基因是連續(xù)的。因此提取原核細(xì)菌的DNA，就可用于PCR的擴(kuò)增。本次實(shí)驗(yàn)的目的基因就是來自一種細(xì)菌編碼的脂肪酶基因。細(xì)菌基因組DNA的提取先是用溶菌酶及蛋白酶K裂解細(xì)胞，釋放DNA、RNA及蛋白質(zhì)等。然后用苯酚/

5、氯仿處理，使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)離心去除蛋白質(zhì)及細(xì)菌碎片，DNA和RNA存在于上清水相中，然后用RNase分解RNA，酒精沉淀DNA，即可獲取目標(biāo)基因組DNA。實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖DNA的電泳DNA分子是兩性電解質(zhì)，在溶液中形成兼性離子而攜帶電荷，帶電分子在電場中將產(chǎn)生移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電分子在電場中移動(dòng)的快慢，除受到場強(qiáng)、緩沖液類型及緩沖液離子強(qiáng)度等外界因素的影響外，還受到分子的大小、帶電量及分子的形態(tài)等自身因素的影響。為避免斷電后電泳分開不同DNA分子的迅速擴(kuò)散混合，DNA電泳常采用瓊脂糖的凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)三 PCR擴(kuò)增目的基因1985年美國Cetus公司的穆利斯等人設(shè)計(jì)并研究成功了一種體外核酸

6、擴(kuò)增技術(shù)PCR（Polymerase Chain Reaction），從而榮獲了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，利用半保留復(fù)制的原理，以待擴(kuò)增的DNA為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異的DNA片段。將目的基因DNA在高溫（94）下解鏈成為單鏈模板；人工合成的一對與目的基因兩側(cè)序列相互補(bǔ)的寡核苷酸引物在低溫（4060）下分別與變性的目的基因片段兩側(cè)的兩條鏈的部分序列互補(bǔ)結(jié)合；在中等溫度（6575）下由耐熱DNA聚合酶（Taq酶）將dNTP中的脫氧單核甘酸加到引物3-OH末端，并以此為起點(diǎn)，沿著模板以53方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。新合成的D

7、NA鏈的起點(diǎn)是由加入的引物在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)決定的。由于PCR反應(yīng)中，雙鏈DNA高溫變性成單鏈，引物與模板單鏈DNA低溫退火（配對），適溫下引物延伸3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，每一循環(huán)所形成的DNA分子均能成為下一循環(huán)的模板，所以PCR的特定目的DNA產(chǎn)物以指數(shù)方式遞增，在數(shù)小時(shí)內(nèi)，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，理論上可使DNA擴(kuò)增至10億（230=109）倍。并且原來對單拷貝基因進(jìn)行探測和分析時(shí)需用10g基因組DNA，現(xiàn)在可以減少到ng水平。樣品DNA預(yù)變性雙鏈DNA解鏈，94 5min引物與單鏈模板DNA結(jié)合 30-60，30秒-雙鏈DNA解鏈聚合酶合成新鏈 94、40秒 65-75、2min延伸反應(yīng)

8、完成實(shí)驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物的純化實(shí)驗(yàn)五 DNA的酶切反應(yīng)基因工程技術(shù)必不可少的工具酶之一，是限制性內(nèi)切酶，它能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特殊堿基序列。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用特點(diǎn)分成型、型及型3大類，型和型核酸限制性內(nèi)切酶一般由兩個(gè)亞基構(gòu)成，既具有內(nèi)切酶的活性，又有甲基化酶的活性，型和型識(shí)別位點(diǎn)固定但酶切位點(diǎn)不固定。而型酶其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化酶作用活性是分開的，而II型酶識(shí)別位點(diǎn)固定同時(shí)酶切位點(diǎn)也是固定的，因此基因工程中應(yīng)用的是型核酸限制內(nèi)切酶。核酸限制性內(nèi)切酶的命名：以EcoRI為例，第一個(gè)大寫字母E為大腸桿菌的屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母co為大腸桿菌的種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母R為大腸桿菌

9、的菌株名；最后一個(gè)羅馬數(shù)字表示該細(xì)菌中已分離出這類內(nèi)切酶的順序編號。實(shí)驗(yàn)六 DNA酶切產(chǎn)物的過柱純化實(shí)驗(yàn)七 質(zhì)粒的提取將一個(gè)有用的目的DNA片段通過體外重組技術(shù)，轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖及表達(dá)的工具稱為載體。載體種類很多，根據(jù)目的不同選用相應(yīng)的載體，其中質(zhì)粒是最常用的載體。質(zhì)粒（plasmid）是一種獨(dú)立于染色體之外的雙鏈DNA，可自主復(fù)制、攜帶了少量的遺傳信息（如：抗生素抗性基因），自然界質(zhì)粒存在于原核生物及低等的真核生物（如酵母、霉菌），自然界發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒均有缺陷，必須經(jīng)過改造才能應(yīng)用于基因工程。理想的質(zhì)粒載體包含：一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)選擇性抗性標(biāo)記人工合成的多克隆位點(diǎn)（multiple cloni

10、ng site，MCS）含有多個(gè)核酸限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)具有較小的相對分子量和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒具有不相容性（incompatibility）或不親和性，是指在沒有選擇壓力的條件下，兩種親緣關(guān)系密切，攜帶相同復(fù)制原點(diǎn)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的提取常用堿法提?。豪帽砻婊钚詣㏒DS溶解細(xì)胞膜上的磷脂和蛋白質(zhì)，在PH高達(dá)12.6的堿性條件下使染色體DNA變性，而分子量較小的質(zhì)粒DNA只是部分變性，當(dāng)醋酸鉀重新調(diào)回PH至中性時(shí)，質(zhì)粒復(fù)性恢復(fù)原狀，而該復(fù)性條件下染色體DNA不能完全復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與菌體蛋白及細(xì)菌碎片凝集成塊，經(jīng)離心去除，而上清中含有質(zhì)粒DNA、少量蛋

11、白及RNA，經(jīng)去除蛋白及RNA后，即可獲取質(zhì)粒DNA。pBSSK質(zhì)粒的圖譜實(shí)驗(yàn)八 DNA的重組連接質(zhì)粒與目的基因經(jīng)核酸限制性內(nèi)切酶酶切后形成的DNA末端有兩類：平末端和黏性末端。按照一定比例將質(zhì)粒和目的基因混合后，加入DNA連接酶，DNA連接酶能酶促合成相鄰核苷酸之間的單鏈缺口，形成磷酸二酯鏈，很顯然，含黏性末端的DNA片段之間的連接效率，要明顯高于平末端的DNA片段間的連接。 實(shí)驗(yàn)九 感受態(tài)細(xì)菌的制備 DNA重組分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳形狀，這個(gè)導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化（transformation）。

12、在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象。在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與宿主菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與宿主菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。所謂感受態(tài)，即指宿主細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由宿主菌的遺傳特性所決定，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子等影響。據(jù)報(bào)道cAMP可以使感受態(tài)水平提高10000倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在指數(shù)期，新鮮柔嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。對于Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化而言，菌齡、CaCl2處理時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）的保存期以及熱擊時(shí)間均是很重

13、要的因素，其中感受態(tài)細(xì)胞通常在1224h內(nèi)轉(zhuǎn)化效率最高，之后轉(zhuǎn)化率急劇下降。因此在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)至OD600為0.40.6后放入冰浴中使其終止生長，然后將菌株置于低溫與處理的低滲CaCl2溶液中，即造成細(xì)胞膨脹，使細(xì)胞通透性發(fā)生短暫性變化，從而極易與外源DNA相黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱擊（heat shock），外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，是宿主細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基里培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（transformant），即帶有異源DNA分子的宿主細(xì)胞。實(shí)

14、驗(yàn)十 重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 外源DNA與載體分子的連接即為DNA重組技術(shù)，重組的DNA分子式在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連接起來。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過各種方法篩選出重組子，并可通過酶切電泳進(jìn)行重組子的鑒定。三、主要儀器設(shè)備在基因工程實(shí)驗(yàn)中用到的儀器主要包括：旋渦混合器、離心機(jī)、電泳槽、烘箱、PCR儀、冰箱等。此外，實(shí)驗(yàn)中所用工具還包括常見實(shí)驗(yàn)工具如：離心管、移膠板、eppendorf管、移液器等。四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)一 含GFP基因質(zhì)粒的提取實(shí)驗(yàn)步驟

15、：1. 取菌液0.51ml，12000r/min離心10秒鐘，棄上清液2. 在旋渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散3. 加入400uL含溶菌酶的GTE溶液（含葡萄糖、Tris-Hcl 緩沖液和EDTA），在旋渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散4. 37度保溫20分鐘。5. 加酚氯仿異戊醇400ul,渦旋混勻，6. 12000r/min離心5min，將上清液移至新的離心管中。7. 向上清液中加入1/10體積(約40uL)的3mol/l醋酸鈉(pH5.2)，混勻，加入1mL的乙醇（約2倍體積的無水乙醇），混勻，-20度靜止30min沉淀DNA，取出，12000r/min離心10min。8. 小心棄上清

16、液，用1mL的70%乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清，放入55度烘箱中3分鐘，除去乙醇9. 用50uL含RNaseA的TE溶解，37度溫浴30min，除去RNA10. 取5uL樣品進(jìn)行電泳。樣品貯存再4度冰箱中。實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖DNA的電泳實(shí)驗(yàn)操作：1. 稱取0.7克的瓊脂糖，加入100ml 0.5TBE，在微波爐上加熱，使瓊脂糖熔解2. 等凝膠溫度降至大約55以下時(shí)，加入5l 的0.5 mg/L溴化乙錠（EB）。3. 將移膠板放入膠室中，并將梳子垂直安插在移膠板上方，將凝膠倒入膠室中。4. 等凝膠完全凝固后(約30分鐘)，將梳子輕輕拔出。5. 將凝膠體放入加有0.5TBE

17、電泳緩沖液的電泳槽中，并且使電泳緩沖液高出凝膠。6. 取2l6上樣緩沖液與5 lPCR產(chǎn)物混勻后，加到凝膠孔中，7. 加入如3 l的l/HindIII marker*。8. 蓋好電泳槽蓋子，選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷海?00V）以及電泳方向，開始電泳。9. 前面色素接近膠的先端，切斷電流，停止電泳，打開槽蓋。10. 取出樣品，在紫外燈下觀察，攝像。實(shí)驗(yàn)三 PCR擴(kuò)增目的基因?qū)嶒?yàn)操作1. 取一個(gè)0.2ml eppendorf管，添加以下各種成分反應(yīng)液 ddH2O 36.5 l模板DNA 5 l（100-200ng）*1上游引物(10mol/L) 1 l下游引物(10mol/L) 1 ldNTP mixt

18、ure(10mmol/L) 1l（各20nmol） 10倍緩沖液+ MgCl2 5 lTaq酶 0.5l （2.5 U）總體積 50 l 2. 稍作離心,將反應(yīng)管放入PCR儀中。3. 設(shè)定反應(yīng)程序： 94條件下使模板DNA預(yù)變性5min。變性 94 30秒退火 58 30秒 30 cycles延伸 72 1.0 min最后在72條件進(jìn)行延伸7-10min。 4 保存4. 取5 l反應(yīng)液用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,鑒定PCR產(chǎn)物是否存在以及大小。實(shí)驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物的純化實(shí)驗(yàn)操作1.電泳確認(rèn)后將PCR產(chǎn)物移至1.5ml新的eppendorf管中。2.加入200l TE緩沖液，加入300 l酚/氯

19、仿/異戊醇，混勻，室溫，12000 rpm離心5分鐘。* 3.取上層水液添加1/10體積（約30l）的3mol/L的NaAc（pH5.2）和2.5倍體積（約0.75ml）的冰冷無水乙醇。4.-20冰箱中放置30 min以上。5.4、12000 rpm離心5 min。6.棄上清，添加1 ml的冰冷70%乙醇。4、12000 rpm離心5 min。7.棄去上清，室溫干燥，30l TE液溶解沉淀。實(shí)驗(yàn)五 DNA的酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)步驟：1. 在0.5 ml eppendorf管中加入下列成分，（定容40l ）AddH2O 2l PCR產(chǎn)物 30l（5g） 10緩沖液 4lXho 2lBamHI 2l總體積

20、 40lBddH2O 2lpET質(zhì)粒 30l 10緩沖液 4lXho 2lBamHI 2l總體積 40l2. 混勻，少許離心一下。3. 在37條件下反應(yīng)2-4小時(shí)以上，或酶切過夜。4. 取5 l酶切質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳，預(yù)檢。實(shí)驗(yàn)六 DNA酶切產(chǎn)物的過柱純化1. 反應(yīng)管中加Buffer B3 250l，輕彈混合均勻2. 裝柱，將pET的雙酶切產(chǎn)物混合液加在柱子白色填料區(qū)，靜置1分鐘，8000rpm離心1分鐘并棄去上層廢液。3. 分別加入500lWash solution,9000rpm離心30s棄去廢液。4. 重復(fù)步驟3，棄去廢液后再在9000rpm條件下空離1分鐘。5. 分別將兩個(gè)柱子轉(zhuǎn)入新管，

21、在柱中心加20lElution，靜置1分鐘，離心1分鐘。收集產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)七 質(zhì)粒的提取實(shí)驗(yàn)步驟1. 取1.5ml培養(yǎng)液在4、12000rpm離心2min，棄去上清液，收集菌體。2. 加入100l的溶液I，使菌體充分懸浮，室溫條件下靜置5min。3. 加入200l新配置的溶液II，溫和上下顛倒2-3回，冰浴條件下靜置5min。4. 加入150l的溶液III，上下顛倒混勻數(shù)次，冰浴條件下靜置5min。5. 4條件下12000 rpm離心10min。6. 取上清，加入等體積（400l）的酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，室溫條件下12000rpm離心5min。7. 吸取上層水相，加入1/10體積量（約40l

22、）3 mol/L的pH5.2 NaAc，再加入2.5倍體積（約1ml）的預(yù)冷的無水乙醇。8. 放入-20冰箱中靜止30 min，然后在4條件下12000rpm離心15min。9. 棄去上清液，加入1 ml 預(yù)冷的70%乙醇，在4條件下12000rpm離心5 min，洗滌沉淀。10. 棄上清液，沉淀物自然干燥后，加入40l TE緩沖液溶解沉淀（pET質(zhì)粒用25 TE溶解）。11. 加入2l的10 mg/ml的RNaseA酶，37保溫20-30 min。12. 取5l的質(zhì)粒電泳。實(shí)驗(yàn)八 DNA的重組連接實(shí)驗(yàn)步驟：1. 在離心管中加入以下樣品： PCR產(chǎn)物 6lpET/酶切產(chǎn)物 2l 10連接緩沖液

23、 1l T4 DNA連接酶 1l2. 混勻后，離心將液體全部甩到管底。3. 16條件下保溫過夜。4. -20備用實(shí)驗(yàn)九 感受態(tài)細(xì)菌的制備實(shí)驗(yàn)步驟：1. 接種BL21于LB培養(yǎng)基中37振蕩培養(yǎng)過夜。2. 接100l培養(yǎng)液于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，37條件下振蕩培養(yǎng)2-2.5小時(shí)左右，OD600達(dá)0.4。3. 將1.5ml培養(yǎng)液移至eppendorf管中、冰浴20min。4. 4條件下，4000rpm離心5min，棄去上清液。5. 添加0.75 ml預(yù)冷的CaCl2溶液，用槍輕輕吹打。6. 冰浴30分鐘后，4條件下，4000rpm離心5min，棄去上清液。7. 細(xì)胞沉淀用100 l預(yù)冷的CaCl

24、2溶液懸浮。8. 冰浴放置，備用。實(shí)驗(yàn)十 重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1. 取一管100l的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒與目的基因的連接產(chǎn)物5l，輕輕用槍吹打均勻，冰浴20 min 2. 42、保溫90秒鐘，迅速放入冰中，冰浴5 min。3. 添加1 ml的LB培養(yǎng)基。4. 37振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。5. 3000 rpm 離心5 分鐘，棄去1ml上清，余下0.1ml用槍吹勻，吸至含有抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，均勻涂布。6. 37倒置培養(yǎng)8-12小時(shí)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析圖1上圖為GFP雙酶切回收的電泳結(jié)果，從圖中可以看出，在實(shí)驗(yàn)一：含GFP基因質(zhì)粒的提取中，還是比較成功的，即獲取了目標(biāo)基因組的DNA。圖2上圖為PC

25、R擴(kuò)增后的電泳結(jié)果（左五）從圖中可以看出，在此次電泳中，我的PCR產(chǎn)物并沒有很成功地產(chǎn)生。由于在實(shí)驗(yàn)一中的結(jié)果并沒有出現(xiàn)問題，因此我分析實(shí)驗(yàn)三的電泳結(jié)果之所以會(huì)失敗，應(yīng)該是在實(shí)驗(yàn)二或是實(shí)驗(yàn)三的過程中出現(xiàn)了操作失誤或是其他不可控因素。在實(shí)驗(yàn)三的操作步驟中，主要部分為取一個(gè)0.2ml eppendorf管，添加各種成分反應(yīng)液。由于各種反應(yīng)液要添加的量都比較小，而且添加順序比較固定，不能出現(xiàn)亂序添加的情況，這些都是可能造成實(shí)驗(yàn)失敗的因素。但經(jīng)過回憶，我在添加各反應(yīng)液的過程中使用的是設(shè)定好吸取容量的移液器，也沒有出現(xiàn)容量錯(cuò)誤、吸取排出不到位等現(xiàn)象。由于是排隊(duì)添加，順序與周圍同學(xué)進(jìn)行添加的順序也是一致的

26、，因此我分析在添加反應(yīng)液這一步?jīng)]有出現(xiàn)失誤。根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟，在添加反應(yīng)液過后應(yīng)該稍作離心，再放入PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。我在添加反應(yīng)液之后，因?yàn)橄胧垢鞣N反應(yīng)液更好融合，在離心之前將eppen dorf管在旋渦反應(yīng)器上進(jìn)行了時(shí)長約15秒的渦旋。我猜想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失敗很有可能與這次渦旋有關(guān)。在渦旋的過程，振蕩太過激烈，破壞了原有的基因組DNA，因此在之后的PCR擴(kuò)增中沒有出現(xiàn)產(chǎn)物。鑒于這一步驟的實(shí)驗(yàn)失敗，為了順利進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)，我吸取了老師提供的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以完成隨后的實(shí)驗(yàn)。圖3上圖為熒光蛋白的電泳結(jié)果（左三），從圖中可以看到，雖然顯示不是特別明顯，但是基本還算比較成功，可以作為熒光蛋白的培養(yǎng)菌落。圖4上圖為實(shí)驗(yàn)最后的熒光蛋白結(jié)果，從圖中可以看到，熒光蛋白成功培養(yǎng)了出來，亮點(diǎn)清晰，但是數(shù)量較少，密度較小?？傮w來說算是完成了整個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求，但是由于某些因素造成了菌落生長的不均勻與小數(shù)量。我分析出現(xiàn)這種情況的原因大概跟我在將細(xì)胞鋪勻到平板上是出現(xiàn)了操作失誤。在將反應(yīng)管中的細(xì)胞液吸至平板的過程中，我錯(cuò)誤地將一半左右的細(xì)胞液鋪在了沒有營養(yǎng)的平板蓋上面。雖然在金老師的幫助下將那一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到了正確的位置，但是有可