實時熒光定量PCR的原理與應(yīng)用.ppt

1、,第六章 第二節(jié) 實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR),提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用,實時熒光定量PCR定義,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法,實時熒光定量PCR 原理 實時原理,常 規(guī) PCR技術(shù)： 對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測,實時定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號的變化實時檢

2、測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析,熒光PCR及特點,1、熒光PCR 就是在利用熒光信號檢測整個PCR擴增過程，獲得在線描述PCR過程動力學(xué)曲線。 實時熒光PCR帶來的好處是熟悉傳統(tǒng)方法的人所無法想象的!,2、特點,閉管方式進行，操作簡便，杜絕了產(chǎn)物污染源 非平臺期檢驗，重現(xiàn)性好 利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該CT值具有極好的重復(fù)性 擴增檢測合二為一，降低了傳統(tǒng)方法過多人為因素的影響，使檢測的自動化水平大幅提高,實時熒光定量PCR原理定量原理,介紹三個概念： 擴增曲線、熒

3、光閾值、Ct值,如何對起始模板定量？,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進行定量分析,實時熒光定量PCR 原理 - 擴增曲線,實時熒光定量PCR 原理 -熒光閾值,熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號:熒光信號超過域值,實時熒光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信

4、號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù),Ct值（Threshold Cycle ）,C代表Cycle ，t代表threshold： PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定對數(shù)增長的最下限，通常設(shè)定在S型擴增曲線的增長的拐點處附近。,Ct值的含義：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。,相同模板在同一臺PCR儀上進行96次擴增的擴增曲線圖 （終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性),Ct值的特點： Ct值則極具重現(xiàn)性,Ct值的確定,實時熒光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想

5、的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率,Ct與初始模板的關(guān)系,固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比 固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比 初始DNA量越多, 熒光達到閾值時所需要的循環(huán)數(shù)(Ct 值)越少 起始模板的對數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計算出樣品中所含的模板量,實時熒光定量PCR 原理 - 標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線： 模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Ct與起始模板量的對數(shù)呈反比關(guān)系。 PCR擴增過程中引入一系列起始濃度的模板與未知樣品同時進行擴增，利用該系列模板

6、的Ct值與已知濃度對數(shù)做直線回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算未知樣品的起始模板濃度。,熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定未知樣品的 C(t)值 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量,實時熒光定量PCR原理 絕對定量,提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用,非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon,實時熒光定量PCR 原理 - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記,實時熒光定量PCR 方

7、法 - 以SYBR Green 法為例,SYBR Green,SYBR Green法工作機理,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。,SYBR Green,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,實時熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析,將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT),Tm,SYBR Green

8、 法 融解曲線分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少 Log模板DNA濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立,反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測 Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準(zhǔn) MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物 反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化 反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定 其他與常規(guī)PCR相同,SYBR Green 法 應(yīng)

9、用范圍,起始模板的測定 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。,SYBR Green 法 優(yōu)缺點,提 綱,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用,實時熒光定量PCR原理 實時熒光定量PCR的幾種方法介紹 實時熒光定量PCR實驗設(shè)計及應(yīng)用,實時熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品,相對定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小 內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量,絕對

10、定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA,實時熒光定量PCR法 定量方法,絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線 相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達差異（不同時相）,實時熒光定量PCR法 絕對定量方法,實時熒光定量PCR法 TaqMan法舉例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺腫瘤 組織標(biāo)本中的表達差異,TaqMan法舉例 標(biāo)記探針,使用 TaqMan 探針進行雙通道熒光定量,Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針 VIC標(biāo)記看家基因探針,TaqMan法舉例 材料準(zhǔn)備,從正常乳腺組織中提取的總 RNA 從乳腺癌組織中提取的 總RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)

11、粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線 單雙通道同時進行，獨立分析 Controls no RNA：陰性對照 RNA + no reverse transcriptase：基因組對照,TaqMan法舉例 癌癥標(biāo)記物表達,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法舉例 實驗結(jié)果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies