基因工程及其應(yīng)用課件(上課)

1、最新款的摩托車(chē),你想過(guò)嗎?,誰(shuí)能告訴我這是？,誰(shuí)能告訴我這是？,香 蕉 魚(yú),你見(jiàn)過(guò)嗎?,你知道什么是真正的碩果累累嗎?,給科學(xué)插上想象的翅膀， 你會(huì)收獲更多！,一、基因工程與基因,基因決定性狀,家蠶能夠吐出蠶絲為人類(lèi)利用,豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮,青霉菌能產(chǎn)生對(duì)人類(lèi)有用的抗生素青霉素,二、基因的認(rèn)識(shí),1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨(dú)立分配規(guī)律。1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)，遺傳學(xué)的元年,1866年，孟德?tīng)枺↗ohann Gregor Mendel， 18221884）提出了遺傳因子（hereditary factor）的概念。 他將控制豌豆性狀的遺傳因素稱之為遺傳因子形

2、成了基因的雛形。,（1856-1864豌豆雜交實(shí)驗(yàn)）,1、基因的發(fā)展過(guò)程,1909年，丹麥的遺傳學(xué)家Wilhelm Ludwig Johanssen (1859-1927)。 根據(jù)希臘語(yǔ)“給予生命”之義，創(chuàng)造了“gene”一詞，并用這個(gè)術(shù)語(yǔ)代替孟德?tīng)柕摹斑z傳因子”。不過(guò)他所說(shuō)的基因并不代表物質(zhì)實(shí)體，而是一種與細(xì)胞的任何可見(jiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)毫無(wú)關(guān)系的抽象單位。因此，那時(shí)所指的基因只是遺傳性狀的符號(hào)，還沒(méi)有具體涉及基因的物質(zhì)概念。,“遺傳因子/基因”的設(shè)想一經(jīng)提出，便推動(dòng)人們?nèi)ふ?，去探?基因在哪里？ 基因是什么？,顯微鏡技術(shù)與染色技術(shù)的發(fā)展，使人們注意到，細(xì)胞分裂時(shí)，尤其是減數(shù)分裂中，染色體的行為和孟

3、德?tīng)柼岢龅牡任换虻姆蛛x規(guī)律相當(dāng)一致，所以，確定基因在細(xì)胞核中，在染色體上。,第一次將代表某一特定性狀的基因與某一特定的染色體聯(lián)系起來(lái)，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論。隨后遺傳學(xué)家又應(yīng)用當(dāng)時(shí)發(fā)展的基因作圖（gene mapping）技術(shù)，構(gòu)筑了基因的連鎖圖，進(jìn)一步揭示了在染色體載體上基因是按線性順序排列的。 。,1910年，美國(guó)遺傳學(xué)家摩爾根（Thomas Hunt Morgan,1866-1945）以果蠅為研究材料，發(fā)現(xiàn)了連鎖交換定律并提出遺傳粒子學(xué)說(shuō)。,1933,發(fā)現(xiàn)DNA的遺傳功能，始于1928年英國(guó)科學(xué)家格里菲斯（PGriffith）所做的用肺炎雙球菌感染小鼠的實(shí)驗(yàn)。首次發(fā)現(xiàn)了基因是一類(lèi)特殊生

4、物分子的證據(jù)。,Frederic Griffith 18791941,格里菲斯用肺炎球菌做實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)令人驚異的現(xiàn)象： 加熱殺死的能致病的S型菌不能致病的R型菌混合注射到小鼠體內(nèi)小鼠病死從死鼠體內(nèi)分離出大量的S型肺炎球菌 難道S型致病菌復(fù)活了嗎？這就是著名的“格里菲斯之謎”。,艾弗里等人的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明使細(xì)菌性狀發(fā)生轉(zhuǎn)化的因子是DNA（即脫氧核糖核酸），而不是蛋白質(zhì)或RNA（即核糖核酸）。不僅揭開(kāi)了“格里菲斯之謎”，并且在世界上第一次證明基因就在DNA上。,Oswald Theodore Avery (18771955),1944年，艾弗里首次證實(shí)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)是DNA，基因位于DNA上。實(shí)驗(yàn)材

5、料是肺炎鏈球菌，他們發(fā)現(xiàn)死去的S型菌并未復(fù)活，而是S型菌的DNA進(jìn)入了R型菌，使其轉(zhuǎn)化為新的S型致病肺炎雙球菌。,美國(guó)微生物學(xué)家阿爾弗雷德戴赫爾希（Alfred Day Hershey，19081997）他們的實(shí)驗(yàn)材料是T2噬菌體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的噬菌體是核酸；進(jìn)而說(shuō)明，攜帶遺傳信息的是核酸，而不是蛋白質(zhì)。噬菌體的DNA不但包括噬菌體自我復(fù)制的信息，而且包括合成噬菌體蛋白質(zhì)所需要的全部信息。1952年，赫爾希和他的學(xué)生共同發(fā)表報(bào)告，肯定了艾弗里的結(jié)論。 此后，再也無(wú)人懷疑DNA是遺傳物質(zhì)了。,1969,1953年，F(xiàn)rancis Crick 和 James Watson 創(chuàng)立DNA雙螺旋

6、模型，證實(shí)基因是具有一定遺傳效應(yīng)的DNA片段。用分子結(jié)構(gòu)的特征解釋生命現(xiàn)象最基本問(wèn)題之一基因復(fù)制的機(jī)理，從而使生物學(xué)真正進(jìn)入分子生物學(xué)的新時(shí)代。,1953,1961年，美國(guó)生物學(xué)家尼倫伯格（Marshall Warren Nirenberg，1927）等人成功破譯了遺傳密碼，以無(wú)可辯駁的科學(xué)依據(jù)證實(shí)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的正確性。人們對(duì)遺傳機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識(shí)。,1967年發(fā)表了全套的遺傳密碼表。,1968,理論上的三大發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是 DNA發(fā)現(xiàn)了 DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理發(fā)現(xiàn)了遺傳信息的傳遞方式,基因工程的準(zhǔn)備階段,技術(shù)上的三大發(fā)明：,1967 發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶；

7、 1970 Khorana實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)T4噬菌體DNA連接酶； 1972 建立雙鏈DNA的連接方法。,3.基因工程的載體:Genetic engineering vector 1972,2.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn):Restriction enzyme 1970,1.DNA連接酶的發(fā)現(xiàn): DNA ligase 1967,獨(dú)立于染色體外的遺傳因子： 細(xì)菌的性因子 F 因子; 抗藥性因子（R ）; 大腸桿菌素因子（COE）,基因工程誕生的理論基礎(chǔ):,1.DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立 3.遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定,1.剪刀:限制性核酸內(nèi)切酶 2.針線:DNA連接酶 3.運(yùn)輸工具:質(zhì)粒

8、等,基因工程誕生的技術(shù)保障:,1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。,Sr,PSC101 R6-3： 質(zhì)粒 Ner： 抗新霉素基因 Sr ： 抗黃胺基因 Tcr： 抗四環(huán)素基因,1986 Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),1986,Stanley Cohen,Herbert Boyer,非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)。,基因工程：即 。通俗的說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基

9、因提取出來(lái)，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里， 地改造生物的 。,原 理：,操作水平：,結(jié) 果：,一、基因工程,基因重組,DNA分子水平,定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類(lèi)所需要的品種。,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),定向,遺傳性狀,二、基因操作的工具,1、基因工程的,指“ 限制性核酸內(nèi)切酶 ”,主要存在于微生物（200種）,一種限切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列,并在特定切點(diǎn)切割DNA分子,已發(fā)現(xiàn)的有4000多種,大腸桿菌(E.coli)的一種限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。,限制性核酸內(nèi)切酶,切割結(jié)果:產(chǎn)生黏性末端,被限制性核酸內(nèi)切酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈

10、的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,限制性內(nèi)切酶（EcoR）作用過(guò)程,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)粘性末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)粘性末端。,如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制性核酸內(nèi)切酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的粘性末端，然后讓兩者的粘性末端粘合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,Sma,平末端平末端,產(chǎn)生平末端:如Sma限制性核酸內(nèi)切酶,切割的化學(xué)鍵：磷酸二酯鍵,例：限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GATC。在質(zhì)粒上有酶的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基

11、因的兩側(cè)各有1個(gè)酶的切點(diǎn)。 請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的粘性末端。 請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的粘性末端,下列關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的說(shuō)法正確的是（ ） A.限制性核酸內(nèi)切酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少 B.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 C.不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA后都會(huì)形成粘性末端 D.限制性核酸內(nèi)切酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵,B,限制酶是一群核酸切割酶，可辨識(shí)并切割DNA 分子上特定的核苷酸堿基序列。下圖為四種限制酶 BamHI , EcoRI , Hind 以及 BgI的辨識(shí)序列： 箭頭表示每一種限制酶的特定切割

12、部位，其中哪兩種限制酶所切割出來(lái)的DNA片段末端，可以互補(bǔ)結(jié)合？其正確的末端互補(bǔ)序列為何？（ ） ABamHI和EcoRI；末端互補(bǔ)序列AATT BBamHI和Hind ；末端互補(bǔ)序列GATC CBamHI和BgI；末端互補(bǔ)序列GATC DEcoRI和Hind ；末端互補(bǔ)序列AATT,C,2、基因工程的,指“DNA連接酶”,將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的DNA分子,DNA連接酶的作用過(guò)程,DNA連接酶的作用位點(diǎn)是：相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的切口。即生成：磷酸二酯鍵。,DNA連接酶,3、基因的運(yùn)載體,（2）應(yīng)具備條件：,能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或與染色體、DNA整合后進(jìn)行同步復(fù)

13、制,具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供目的基因插入其中,具有某些標(biāo)記基因，供重組DNA的檢測(cè)和鑒定,（3）常用類(lèi)型：,（1）功能：將目的基因送入受體細(xì)胞,質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)、植物病毒等,標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測(cè)。,其中質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌和酵母菌等生物中,是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子.,步驟一：獲取目的基因,目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因, 獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步 。,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因，植物的抗病基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,從基因文庫(kù)中獲取目的基因：,基因文庫(kù): 一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性核酸內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片

14、段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫(kù)。 (gene library).,1 . “鳥(niǎo)槍法”（“散彈射擊法”） 用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過(guò)運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來(lái)。,(1)反轉(zhuǎn)錄法：,2.人工合成基因,(2)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA ：,步驟二：制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）,（

15、1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。 （2）用同一種限制酶切斷帶有目的基因的外源DNA片段，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。 （3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。,目的基因與載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重新組合的過(guò)程。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑，如土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。,步驟三：轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將攜帶目的基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞）,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)）,2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（顯微注射技術(shù)）,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,大腸桿菌細(xì)胞最常用

16、的轉(zhuǎn)化方法是: （1）用CaCl2處理細(xì)菌，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。 （2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。 （3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。,步驟四：篩選出獲得目的基因的重組細(xì)胞,步驟五：培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),重組的DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)過(guò)程。,受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？,若不能表達(dá)，要對(duì)抗蟲(chóng)基因再進(jìn)行修飾。,思考：依照中心法則分析番茄軟化的原因：,熒光蛋白酶基因轉(zhuǎn)化花卉,哪些新技術(shù)能大大簡(jiǎn)化基因工程的操作技術(shù)？,

17、1、DNA測(cè)序儀： 2、PCR技術(shù)：,能快速地測(cè)定DNA樣品的堿基序列。,在體外通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇的大量擴(kuò)增目的基因或序列的技術(shù)。, 概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是一項(xiàng)在體外通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增目的基因或序列的技術(shù) 。,條件：目的基因或序列、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、一對(duì)引物(做啟動(dòng)子),原理： DNA復(fù)制,方式：以指數(shù)方式擴(kuò)增。,結(jié)果：,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,90-95變性, 50-65退火,70-75延伸,PCR反應(yīng)過(guò)程：,20-40個(gè)PCR循環(huán),1個(gè)PCR 循環(huán),過(guò)程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在

18、熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性50-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,四、基因工程的應(yīng)用,1、基因工程與作物育種,（Antifreeze Proteins AFPs),避免細(xì)胞結(jié)冰 有助植物抗凍,抗凍糖蛋白,無(wú)冰晶細(xì)菌幫助草莓抗霜凍,降低原生質(zhì)冰點(diǎn),抑制冰晶重結(jié)晶,修飾冰晶形態(tài),調(diào)節(jié)原生質(zhì)膠體性質(zhì),抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物,生長(zhǎng)快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(yú)(中國(guó)),乳汁中含有人生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷),轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒,2、基因工程與藥物研

19、制,我國(guó)生產(chǎn)的部分基因工程疫苗和藥物,許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來(lái)源限制產(chǎn)量有限，其價(jià)格往往十分昂貴。,微生物生長(zhǎng)迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問(wèn)題，還能大大降低生產(chǎn)成本。,胰島素從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。,將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！使其價(jià)格降低了30%-50%!,基因工程做成的“超級(jí)細(xì)菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。,通常一種假單孢桿菌只能分解石油中的一種烴類(lèi)用基

20、因工程培育成功的“超級(jí)細(xì)菌”卻能分解石油中的多種烴類(lèi)化合物。,科學(xué)家還培育出能吞食轉(zhuǎn)化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質(zhì)的細(xì)菌。,3、環(huán)境污染治理,利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。,轉(zhuǎn)基因食品,安全嗎?!,轉(zhuǎn)基因抗乙肝西紅柿(中國(guó))，雖然不能治愈乙肝，但一年只吃幾個(gè)抗乙肝西紅柿，就完全能代替注射乙肝疫苗?？挂腋挝骷t柿屬于轉(zhuǎn)基因食品，就是將乙肝疫苗植入西紅柿內(nèi)，經(jīng)過(guò)多代繁殖，使轉(zhuǎn)入的基因穩(wěn)定化。,用轉(zhuǎn)基因的植物生產(chǎn)藥物,轉(zhuǎn)基因植物的安全性爭(zhēng)論,支持派認(rèn)為：如果轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)生物技術(shù)得不到社會(huì)支持，這一研究將被扼殺，并且強(qiáng)調(diào)，迄今為止并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品危害人體健康和環(huán)境的確切證據(jù)。,美國(guó)人食用轉(zhuǎn)基因食品已多年，超級(jí)市場(chǎng)上有4000多