多克隆抗體制備

1、多克隆抗體制備,多克隆抗體的制備方法,動物選擇,一、選擇制備多克隆抗體(抗血清)的動物種類應考慮的要點: 需要制備的抗血清的質量; 供給蛋白質抗原的動物與免疫動物之間的種系關系; 免疫動物產生的抗體特性（針對不同性質的免疫原選用相應的動物）。 二、動物的年齡、性別和數量對抗體制備的影響 優(yōu)先選取青壯年動物； 雌性動物的免疫應答狀況,無論是細胞性還是體液性免疫都比雄性個體強烈。,家兔,家兔是最適合制備抗體的動物。 其體型適中,成年體重為26kg,一次采血量可達2550ml,全放血量則達100180ml; 性格馴順,易于操作和采血; 壽命相對較長,為58年; 能生產足夠量的高效價和高親和力的抗血清

2、； 通常適用于制備抗嚙齒類和人蛋白質的抗體； 家兔僅一型IgG而無亞型。用家兔的IgG很容易制備Fc、Fab和F(ab)2等片段,雞,雞的種系距哺乳動物較遠,用以制備抗哺乳動物蛋白質的抗體具有獨特的優(yōu)點。 雞的IgG常稱IgY,其特點是不會激活哺乳動物的補體成分C1,也不會與細菌蛋白A或蛋白質G、哺乳動物的Fc受體或類風濕因子等發(fā)生反應。在極端條件下,雞IgY的穩(wěn)定性不如家兔IgG,不過,雞的IgY在雞蛋內可保持穩(wěn)定達數月之久,純品IgY在中性緩沖液和冷藏條件下則可保存數年之久。用雞IgY已經制備出Fc和單價的Fab或Fab等片段。 雞可將大量IgY輸送入雞蛋黃中, 從雞蛋中收獲抗體可避免采用

3、損傷性的收集手段。,免疫劑量,劑量：免疫原合適劑量的選定應考慮抗原性強弱、分子量大小和免疫時間。大動物抗原劑量（以蛋白抗原為準）約0.51mg/只，小動物約0.10.6mg/只。如無免疫佐劑可適當提高免疫劑量（10-20倍）。 乳化：一般抗原與免疫佐劑體積比1:1混合。首次免疫采用完全佐劑，加強免疫采用不完全佐劑。,（1）延長抗原釋放時間； （2）增加抗原的表面積； （3）佐劑能刺激吞噬細胞對抗原的處理；（4）增強輔助T細胞的作用； （5）刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞產生抗體。使無免疫原性物質變成有效的免疫原； （6）改變抗體的產生類型以及產生遲發(fā)型變態(tài)反應，并使其增強。,免疫方式,注射途徑

4、：免疫注射的途徑也很重要。一般采用多點注射，一只動物注射總數約為810點，包括足掌及肘窩淋巴結周圍，背部兩側、頜下、耳后等處皮內或皮下，皮內易引起細胞免疫反應，對提高抗體效價有利,免疫方式,間隔與免疫時間：第一次免疫后，因動物機體正處于識別抗原和b細胞增殖階段，如很快接著第二次注入抗原，極易造成免疫抑制。一般以間隔1020天為好。二次以后每次的間隔一般為710天，不能太長，以防刺激變弱，抗體效價不高。 免疫次數：根據抗體效價要求確定（抗血清滴度測定）,免疫應答,機體免疫系統(tǒng)受到抗原刺激后，免疫細胞發(fā)生一系列變化，并產生一定免疫效應的過程。 (一) 感應階段(inductive stage) 稱

5、致敏階段(sensitization stage)，是抗原物質進入體內，抗原遞呈細胞(APC)對其識別、捕獲、加工處理和遞呈，以及抗原特異性淋巴細胞(T 細胞和 B 細胞)對抗原的識別階段。 ( 二) 增生分化階段(proliferative and differentiative stage) 又稱反應階段(reactive stage)，是抗原特異性淋巴細胞識別抗原后活化，進行增殖與分化，以及產生效應性淋巴細胞和效應分子的過程。T 細胞增殖分化為淋巴母細胞，最終成為效應 T 細胞(或稱致敏 T 細胞)，并產生多種細胞因子；B 細胞增殖分化為漿細胞，合成并分泌抗體。一部分 T、B 淋巴細胞在

6、分化過程中成為記憶細胞(Bm 和 Tm)。在此階段，有多種細胞間的協(xié)作和多種細胞因子的參加。 (三) 效應階段(effective stage) 此階段是由活化的效應細胞(CTL 與 TD 或 TDTH)和效應分子(抗體與細胞因子)發(fā)揮細胞免疫效應和體液免疫效應的過程。這些效應細胞和效應分子共同作用清除抗原異物。,初次應答(primary response),機體初次接受適量的抗原刺激后，引起體內抗體產生的過程稱為初次應答，主要特點為： 機體初次接觸抗原后，需經一定的潛伏期血清中才能出現(xiàn)抗體，潛伏期的長短取決于抗原的性質、抗原進入機體的途徑、所用的佐劑類型、受體情況等，潛伏期之后為抗體的對數上

7、升期，抗體含量直線上升，然后為持續(xù)期，抗體產生和排出相對平衡，最后為下降期； 初次應答最早產生的抗體為 IgM，可在幾天內達到高峰，然后開始下降，接著才產生 IgG，IgG 抗體產生的潛伏期比 IgM 長，如果抗原劑量少，可能僅產生 IgM，IgA 產生最遲，而且含量少； 初次應答產生的抗體總量較低，維持時間也短，通常以 IgM 為主，且抗體的平均親和力較低。,再次應答(secondary response),機體再次接觸相同的抗原時，體內產生抗體的過程稱為再次應答或回憶應答(anamnestic response)，主要特點為： 潛伏期顯著縮短，約為初次應答潛伏期的一半； 抗體含量大幅度上升，比初次應答多幾倍到幾十倍，而且維持時間長； 誘發(fā)再次應答所需的抗原劑量極??； 再次應答產生的抗體主要為 IgG，而 IgM很少，抗體的平均親和力高。如果再次應答間隔的時間越長，機體越傾向于只產生 IgG?？乖镔|如經消化道和呼吸道等粘膜途徑進入機體，可誘導產生分泌型 IgA，在粘膜表面發(fā)揮免疫效應。,血液采集,多克隆抗體純化,蛋白A親和層析 蛋白A可與多種哺乳動物的IgG重