發(fā)酵工程綜合性實(shí)驗(yàn)-2青霉素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1、發(fā)酵工程綜合性實(shí)驗(yàn) 2：青霉素的發(fā)酵 一、目的與要求1、學(xué)習(xí)青霉素生產(chǎn)發(fā)酵的工藝流程；2、學(xué)習(xí)微型發(fā)酵罐（5L）的使用；2、通過實(shí)驗(yàn)，以具體的青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程為例，學(xué)習(xí)發(fā)酵原理，掌握種子制備、發(fā)酵過程控制、與發(fā)酵相關(guān)參數(shù)的檢測，掌握效價測定方法；二、實(shí)驗(yàn)原理1、工藝控制（1）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素基質(zhì)濃度 在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生長抑制）, 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成 , 為了避免這一現(xiàn)象 , 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 , 即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用

2、的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 , 因?yàn)榧词故浅鲎钸m濃度范圍較小的波動 , 都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 , 使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測尚難在線進(jìn) 行 , 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 , 而是間接根據(jù)pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。（2）溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 , 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 C 左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 , 同時增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對菌絲生長和青霉素合成來說 , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段

3、采用較高的溫度，以縮短生長時間, 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 , 以利于青霉素的合成。（3） pH 值 青霉素發(fā)酵的最適 pH 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 , 有時也可以略高或略低一些 , 但應(yīng)盡量避免 pH 值超過7.0, 因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中, pH 值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 pH 值降低； 過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。（4）溶氧 對于好氧的青霉素發(fā)酵來說 , 溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到

4、 30% 飽和度以下時, 青霉素產(chǎn)率急劇下降, 低于 10% 飽和度時, 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高 , 說明菌絲生長不良或加糖率過低, 造成呼吸強(qiáng)度下降, 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個動態(tài)平衡點(diǎn), 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參考指標(biāo)。（5）菌絲濃度 發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度 (取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強(qiáng)度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的

5、消耗速率，而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。（6）菌絲生長速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長速率低于0.015h-1時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比, 當(dāng)比生長速率高于 O. 015h-1時, 比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān) D 因此, 要在發(fā)酵過程中達(dá)到并維持最大比生產(chǎn)速率, 必須使比生長速率不低0.015h-1 。這一比生長速率稱為 臨界比生長速率。對于分批補(bǔ)料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說, 維持0.015h斗的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)

6、酵液體積加倍, 這在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實(shí)現(xiàn)的。事實(shí)上 , 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達(dá)到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長, 故雖然表觀比生長速率低, 但真比生長速率卻要高一些。（7）菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 , 青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸, 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產(chǎn)

7、率甚至高于前者。在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L度, 并避免結(jié)球 , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 , 并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強(qiáng)度及比生長速率密切相關(guān)。3、 工藝控制要點(diǎn)（1）種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25 C 培養(yǎng) 7 天, 真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆谩Ｉa(chǎn)時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ,26 C 培養(yǎng) 56h 左右, 菌絲濃

8、度達(dá)6%-8%, 菌絲形態(tài)正常, 按 10%-15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內(nèi),27C 培養(yǎng) 24h, 菌絲體積 10%-12%, 形態(tài)正常, 效價在700D/ml左右便可作為發(fā)酵種子。球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有O. 5% -1. 0 %玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子, 然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 (又稱生產(chǎn)米), 親米和生產(chǎn)米均為25 C靜置培養(yǎng), 需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4 天, 大米表面長出明顯小集落時要振搖均勻, 使菌絲在大米表面能均勻生長, 待10 天左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng),

9、 生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米300萬只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5 C冰箱內(nèi)。工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 (指收獲后的孢瓶在10天以內(nèi)使用) 接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi),28 C 培養(yǎng) 50-60h當(dāng)pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌絲呈菊花團(tuán)狀,平均直徑在 100- 130m, 每毫升的球數(shù)為 6萬 -8萬只, 沉降率在 85% 以上, 即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 8000-11000只/ml 范圍的要求, 計(jì)算移種體積, 然后接入發(fā)酵罐, 多余的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳, 其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單位的罐

10、批差異減少。（2）培養(yǎng)基成分的控制a. 碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 進(jìn)行流加。b. 氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無機(jī)氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c. 前體 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 G, 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前體對青霉素的毒害。d. 無機(jī)鹽加人的無機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等, 且用量要適度。另外, 由于鐵離子對青霉菌有毒害作用, 必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度, 一般控制在30 g/ml 。（3）發(fā)

11、酵培養(yǎng)的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 , 最好是根據(jù)排氣中CO2 量及 O2 量來控制, 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右, pH 值上升時開始加糖。b. 補(bǔ)氮及加前體 補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素, 使發(fā)酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08% 。c. pH 值控制 對pH 值的要求視不同菌種而異, 一般為 pH 6.4-6.8, 可以補(bǔ)加葡萄 糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制pH值。 d. 溫度控制 前期 2 5- 2 6 C, 后期 23 C, 以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。

12、e. 溶解氧的控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30% 。通風(fēng)比一般為1 : 0. 8L/(L min), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 泡敵 來消泡, 應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量多次加入, 尤其在發(fā)酵前期不宜多用, 否則會影響菌體的呼吸代謝g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 ,根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度, 通過追加糖或補(bǔ)加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間, 以獲得最多青霉素。當(dāng)

13、菌絲中空泡擴(kuò)大、增多及延伸, 并出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞, 這表示菌絲趨向衰老, 青霉素分泌逐漸停止, 菌絲形態(tài)上即將進(jìn)入自溶期, 在此時期由于茵絲自溶, 游離氨釋放, pH 值上升, 導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降, 使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多, 并使發(fā)酵液變蒙古稠, 增加下一步提純時過濾的困難。因此, 生產(chǎn)上根據(jù) 鏡檢 判斷, 在自溶期即將來臨之際, 迅速停止發(fā)酵, 立刻放罐, 將發(fā)酵液迅速送往提煉工段。三、材料和用品實(shí)驗(yàn)用菌種： Penicillium chrysogenum產(chǎn)黃青霉，用于發(fā)酵； Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌，效價檢測

14、用。 實(shí)驗(yàn)藥品：玉米漿、蔗糖、硫酸銨、碳酸鈣、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、無水硫酸鈉、 硫酸錳、牛肉膏、蛋白胨、NaCL、 實(shí)驗(yàn)器皿：滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、小型發(fā)酵系統(tǒng)（用大三角瓶）、烘箱、水浴鍋 、5L發(fā)酵罐四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備和菌種的活化種子培養(yǎng)（種子培養(yǎng)基，25C，搖床培養(yǎng)4852h）上罐發(fā)酵（發(fā)酵培養(yǎng)基，25C搖床培養(yǎng)4d）每16小時取一次樣液，20毫升左右，測PH，青霉素效價，殘?zhí)恰?.實(shí)驗(yàn)步驟（一）種子制備 種子培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的組成（）：玉米漿3.8，蔗糖2，硫酸銨0.2，碳酸鈣0.1，硫酸亞鐵0.02， pH 4.74.9。培養(yǎng)基的分裝及其滅菌 將配好的培養(yǎng)基

15、分裝到 250mL搖瓶中，每瓶 60mL，最后將培養(yǎng)基置于 121 滅菌 20min。 接種 將已經(jīng)活化的斜面種子接種到搖瓶中 25 搖床中培養(yǎng)。 培養(yǎng)時間及鏡檢 一般種子培養(yǎng)需要 2-3d 左右，然后利用鏡檢來檢測培養(yǎng)過程是否染菌。 （二）發(fā)酵過程及控制發(fā)酵培養(yǎng)基配制 培養(yǎng)基的組成（）：玉米漿4，蔗糖1，磷酸二氫鉀0.5，無水硫酸鈉0.5，碳酸鈣 0.07，硫酸亞鐵0.018，硫酸錳0.0025，泡敵0.03，pH 4.74.9。 2培養(yǎng)基裝罐及其滅菌將配好的培養(yǎng)基裝到發(fā)酵罐中，121實(shí)罐滅菌20min。 3接種：將已經(jīng)培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵罐中，25發(fā)酵。 4觀察和取樣：觀察發(fā)酵過程中是否

16、存在異常情況，如發(fā)酵液顏色、氣味、溶氧等是否異常等情況。每16-24h取樣一次，每次20mL左右。 5發(fā)酵時間及鏡檢：發(fā)酵需要 4d 左右，然后利用鏡檢來檢測發(fā)酵過程是否染菌。 （三）發(fā)酵過程中生理生化指標(biāo)的檢測 1.利用稱重法測定生長曲線：將每批次的樣品（5-10mL）離心后稱重，測得不同時間菌體的質(zhì)量，以時間為橫坐標(biāo)，質(zhì)量為縱坐標(biāo)，得到曲線。 2.測還原糖：利用 DNS 法，測定每批次的樣品（5-10mL）離心后的發(fā)酵液的還原糖的含量，以時間為橫坐標(biāo)，含量為縱坐標(biāo)，得到曲線。 （具體測定方法請參照附錄1）（四）青霉素效價測定（利用抑菌圈的實(shí)驗(yàn)方法測定青霉素效價） 1.培養(yǎng)基配制 LB 液體培養(yǎng)基 2.指示菌的培養(yǎng) 選取指示菌金黃色葡萄球菌、枯