土壤微生物的分離純化及鑒定

1、土壤微生物的分離純化及鑒定 一摘要：通過稀釋涂布、劃線分離等微生物的基本實驗操作和步驟，對土壤中的微生物進行分離與純化，再根據(jù)實驗中菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化試驗等結(jié)果對所分離細菌和霉菌的分類進行鑒定。二關(guān)鍵詞：土壤微生物，劃線分離，純化，芽孢染色，革蘭氏染色，鞭毛染色，穿刺，生理生化鑒定三前言：土壤微生物是構(gòu)成土壤肥力的重要因素。土壤中尤以細菌最多，約占土壤微生物總量的70-90%.土壤中不同類型的細菌有不同的作用。有的能夠固定空氣中的氮元素，合成細胞中的蛋白質(zhì)；有的能夠分解農(nóng)作物的秸桿，它們大多是異養(yǎng)菌。除了細菌以外，土壤中數(shù)量較多的其它微生物是放線菌和真菌，而藻類和原生動物等較少

2、。土壤中的微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體。要研究某種微生物的特性或要確定某些微生物菌株的分類地位，首先須使該微生物為純培養(yǎng)。也就是說培養(yǎng)物中所有的細胞只是微生物的某一個或株，它們有著共同的來源，是同一細胞的后代。從復(fù)雜的微生物群體中獲得只含有一種或一株微生物的過程稱為微生物的分離純化。單細胞挑取法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法和平板劃線法是分離純化微生物的常規(guī)方法。通過稀釋涂布平板法可以在平板上獲得單菌落，再通過挑取單菌落進行平板劃線分離可獲得純培養(yǎng)。在稀釋涂布平板法中還可通過平板菌落計數(shù)，推算單位重量土壤樣品含有微生物的數(shù)量。對微生物分類的主要依據(jù)有形態(tài)特

3、征、生理生化特征性等。形態(tài)特征包括個體形態(tài)和培養(yǎng)形態(tài)。細胞形狀、大小、排列，革蘭氏染色反應(yīng)，運動性，鞭毛位置、數(shù)目，芽孢有無、形狀和部位都是個體形態(tài)的特點。培養(yǎng)形態(tài)指微生物在培養(yǎng)基（包括固體和液體培養(yǎng)）中生長的形態(tài)特征。通過細菌的形態(tài)特征可以對微生物進行分類鑒定。各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)出很大的差異，如表現(xiàn)在對大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力以及分解代謝的終產(chǎn)物的不同，反應(yīng)出它們具有不同的酶系和不同的生理特性，這些特性可被用作為細菌鑒定和分類的內(nèi)容。.四實驗材料1.菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。2.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基，固體油脂培養(yǎng)基，固體淀粉培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，

4、乳糖培養(yǎng)基試管（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管），蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。.3.溶液和試劑：50%乙醇，20%的甘油，硝酸銀染色液、香柏油、二甲苯、0.01美蘭水溶液，盧戈氏碘液，甲基紅指示劑，5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液，革蘭氏染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番紅復(fù)染液，香柏油。4.土樣：于山東大學(xué)中心校區(qū)圖書館前光草坪內(nèi)地表10cm下取得土樣。.5.儀器和其他用品：普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙，酒精燈，載玻片，雙層瓶，接種環(huán)，試管架，鑷子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸餾水，蓋玻片，吸水紙，無菌平板，無菌試管，U型玻棒，解剖刀，無菌吸管等。.五操作步驟1培養(yǎng)

5、基的制備與分裝。1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取藥品。2.熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。3.調(diào)pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH至培養(yǎng)基所需pH。4.分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培 養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。5.加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上

6、標簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。2無菌水的制備。（1）用量筒量取90ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（2）用10ml吸管取9ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。3器皿的準備。（1）培養(yǎng)皿的包裝：每10套一包，用舊報紙或牛皮紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴）。（2）吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結(jié)。（3）玻璃涂布棒的包裝：方法同吸管的包裝。（4）槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。4高壓滅菌。（1）將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，根據(jù)需要設(shè)定滅菌溫度和時間（一般121，20min滅菌，若培養(yǎng)基中含有葡萄糖等成分時，113 ，30min滅

7、菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。（2）滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養(yǎng)基冷至50左右，倒平板。5微生物的分離與純化。（1） 制備土壤稀釋液：稱取10g土壤，放入滅好菌的無菌水中用玻璃珠打碎土壤，放置30min以上。然后取10mL土壤原液于1支試管中，再從該試管中取1mL浸液于裝有9mL無菌水的試管中，依次操作，分別將土壤浸液稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，將7支試管按稀釋倍數(shù)分別記作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6號試管。（2） 涂布平板：分別取各稀釋度試管中0.2mL浸液于準備好的細菌培養(yǎng)

8、基平板上，用刮刀分別涂布。再分別取各稀釋度試管中0.2mL浸液于準備好的霉菌培養(yǎng)基平板上，用刮刀分別涂布。每個稀釋度的浸液涂布3個平板。（3） 培養(yǎng)：將細菌培養(yǎng)基平板置于37恒溫箱培養(yǎng)24h，將霉菌培養(yǎng)基平板置于27恒溫箱培養(yǎng)3d。（4） 平板計數(shù)及菌落描述：將培養(yǎng)好的細菌進行平板計數(shù)，計算1g土壤中細菌數(shù)；并觀察其菌落形態(tài)特征，記錄結(jié)果。（5） 平板劃線分離：分別將培養(yǎng)好的細菌、霉菌進行平板劃線分離。分別在適宜溫度培養(yǎng)。（6） 菌種保藏（留作鑒定）：將分離得到的菌種進行斜面保藏。每株菌保存3支斜面。6.分離菌株的鑒定。（1）記錄菌種的培養(yǎng)特征。（2） 細菌的革蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性

9、。制片：制片方法與簡單染色相同。初染：加適量（以剛好覆蓋菌為宜）的結(jié)晶紫染色液染色1.5min，水洗。媒染：碘液媒染1min，水洗。脫色：連續(xù)滴加95%乙醇脫色2030s至流出液無色，立即水洗。復(fù)染：滴加番紅復(fù)染1.5min，水洗。鏡檢：干燥后，油鏡鏡檢觀察。（3）細菌的芽孢染色。制片：按常規(guī)方法涂片、干燥及固定。加熱染色：向載玻片滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱染液冒蒸氣計時并維持5min，加熱時注意補充染液，切勿讓涂片干涸。脫色：待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。復(fù)染：用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min。水洗：用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。

10、鏡檢：將載玻片晾干后油鏡鏡檢。（4）細菌的鞭毛染色。載玻片制備：將載玻片用洗滌劑清洗干凈，置于95%乙醇中浸泡5min，使用時用鑷子取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。制片：在載玻片一端滴一滴清水，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)物種蘸一兩下，再在清水中蘸一兩下，然后傾斜玻片，使液體緩慢流向載玻片另一端，用吸水紙洗去多余液體，自然干燥。染色：滴加硝酸銀染液A液覆蓋菌面35min后用蒸餾水充分洗去A液。用硝酸銀染液B液洗去殘留水分后，再滴加B液覆蓋菌面4050秒，其間可用微火加熱，當(dāng)菌面出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。鏡檢：用油鏡鏡檢觀察。（5） 細菌的半固體穿刺試驗。 培養(yǎng)基試管的制備：將半固

11、體培養(yǎng)基倒入試管中滅菌后，垂直放置待凝。 接種：將各菌種用接種針分別穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，37恒溫箱中培養(yǎng)24h。 觀察：觀察細菌生長范圍并記錄，判斷細菌是否有運動性。（6） 查伯杰氏手冊，初步對細菌菌種進行鑒定。（7） 進行以下細菌的生理生化試驗： 淀粉水解試驗 將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50左右，無菌操作制成平板。 用記號筆在平板底部劃成4個部分。 將選取的各菌分別在不同的部分點一下，在平板的反面分別在4個部分標明所接種細菌。 將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)24h。 觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色

12、透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性。根據(jù)透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。 油脂水解實驗 將熔化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50左右時，充分搖蕩，使油脂均勻分布，無菌操作倒入平板，待凝。 用記號筆在平板底部劃成4部分，分別在4部分標明所接種細菌。 用無菌操作將選取的各菌分別劃十字線接種于平板的相對應(yīng)部分的中心。 將平板倒置，37溫箱中培養(yǎng)24h。 取出平板，觀察菌苔顏色。如出現(xiàn)紅色斑點，說明脂肪水解，為陽性反應(yīng)。 糖發(fā)酵試驗 用記號筆在各試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種細菌。 取數(shù)支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，分別接入所選菌種，另取一支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管不

13、接種，作為對照。取數(shù)支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，同樣分別接入所選菌種，另取一支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管不接種，作為對照。在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。 將接過種和作為對照的試管均置37中培養(yǎng)2448h。 觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。 吲哚試驗 將所選菌種分別接入數(shù)支蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)48h。 向培養(yǎng)基內(nèi)加入34滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)。 甲基紅試驗 將所選菌種分別接入數(shù)支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)48h。 將1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅試劑

14、2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。（8）霉菌的形態(tài)觀察。 培養(yǎng)小室的滅菌：在平皿皿底鋪一張略小于皿底的圓濾紙片，再放一U形玻棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋、包扎后于110滅菌2030min，烘干備用。 瓊脂塊制備：通過無菌操作，用解剖刀由馬鈴薯瓊脂薄層平板上切下1cm2左右的瓊脂塊，將其移至培養(yǎng)小室的載玻片上，每片兩塊。 接種：通過無菌操作，用接種針分別從各霉菌馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物中挑取很少量孢子，接種于小室中瓊脂塊邊緣上，將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。 培養(yǎng)：通過無菌操作，在培養(yǎng)小室中圓濾紙片上加35mL滅菌的20%甘油（用于保持濕度），蓋上皿蓋，于28培養(yǎng)7天。 鏡檢

15、：取出載玻片用低倍鏡和高倍鏡鏡檢。（9） 對照霉菌圖譜，對霉菌菌種進行鑒定。六、實驗結(jié)果1細菌的平板計數(shù)：【表1 】細菌的平板計數(shù)結(jié)果菌液濃度原浸液10-4平板123平均菌落數(shù)13141313.31g土壤中細菌數(shù)：6.7106個1 細菌的形態(tài)觀察：【表2 】細菌菌落的形態(tài)特征記錄細菌編號形狀大小干濕顏色邊緣表面1圓形中等干白色不整齊隆起2圓形中等濕淡黃整齊隆起3圓形小濕白色透明整齊隆起4不規(guī)則大濕乳白透明不整齊不隆起5不規(guī)則大濕白色不整齊不隆起2 細菌的染色半固體穿刺實驗結(jié)果（1） 表格：【表3】細菌的染色半固體穿刺實驗結(jié)果記錄細菌編號形狀革蘭氏染色芽孢染色鞭毛染色半固體穿刺1長桿狀G+有芽孢

16、有鞭毛運動2短桿狀G-無芽孢無鞭毛不運動3短桿狀G+有芽孢無鞭毛不運動4短桿狀G+有芽孢有鞭毛運動5短桿狀G+有芽孢有鞭毛運動（2）圖片：細菌的染色實驗結(jié)果 革蘭氏染色 【圖1】 1號菌革蘭氏染色（10100） 【圖2】 2號菌革蘭氏染色（10100） 【圖3】3號菌革蘭氏染色（10100） 【圖4】4號革蘭氏染色（10100） 【圖5】5號菌革蘭氏染色（10100） 【圖6】金黃色葡萄球菌革蘭氏染色（10100）【圖7】大腸桿菌革蘭氏染色（10100） 芽孢染色 【圖8】1號菌芽孢染色（10100） 【圖9】2號菌芽孢染色（10100） 【圖10】3號菌芽孢染色（10100） 【圖11】4號

17、菌芽孢染色（10100）【圖12】5號菌芽孢染色（10100） 鞭毛染色 【圖13】1號菌鞭毛染色（10100） 【圖14】2號菌鞭毛染色（10100無鞭毛） 【圖15】3號菌鞭毛染色（10100無鞭毛） 【圖16】4號菌鞭毛染色（10100）【圖17】5號菌鞭毛染色（10100）半固體穿刺 【圖18】1號菌半固體穿刺 （有運動性） 【圖19】2號菌半固體穿刺（無運動性） 【圖20】3號菌半固體穿刺（無運動性） 【圖21】4號菌半固體穿刺（有運動性）【圖22】5號菌半固體穿刺（有運動性）【表4】各菌所屬類群菌種編號所屬類群（屬）該屬主要特征1芽孢桿菌屬菌體桿狀，直或接近直，0.3-2.21.2

18、-7.0微米，多數(shù)運動，鞭毛典型側(cè)生。形成抗熱內(nèi)生孢子，在一個孢子囊細胞中，孢子不多于1個。暴露與空氣中時，不妨礙孢子的形成。革蘭氏反應(yīng)為：陽性、僅在生長早期為陽性、陰性。有機化能營養(yǎng)，利用多種底物進行嚴格呼吸代謝，嚴格發(fā)酵代謝或呼吸和發(fā)酵二者兼有的代謝。在呼吸代謝中，最終的電子受體是分子氧，在一些種種可疑用硝酸鹽代替氧，大多數(shù)種產(chǎn)接觸酶。嚴格好氧或兼性厭氧。2不動桿菌屬桿菌，通常非常短粗，對數(shù)期典型菌為1.0-1.51.5-2.5微米，靜止期近乎球狀，排列以成對和短鏈占優(yōu)勢，在所有的培養(yǎng)物中有少量的大而不規(guī)則的細菌和絲狀體，但也可占優(yōu)勢，不形成芽孢無鞭毛。有些菌株在固體的表面在特殊情況下顯示

19、“抽搐”式的運動。莢膜和纖毛可能有或沒有。不產(chǎn)生聚-羥基丁酸鹽細胞內(nèi)含物。革蘭氏染色陰性。具氧化代謝的化能異養(yǎng)菌。作為碳和能源而利用的有機物通常是多樣化的。無特殊的生長需要，從糖類可能或不能產(chǎn)酸。氧化酶陰性，接觸酶陽性。不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇、吲哚和H2S。專性好氧菌，最適溫度為30-32，最適pH約為7?？骨嗝顾?。3，4梭菌屬桿狀，一般以周生鞭毛運動，很少不運動。形成卵園到球形孢子，一般孢子使桿狀菌體膨大，通常為革蘭氏陽性，至少在生長的早期如此。有機化能營養(yǎng)。有些種是解糖的，有些是解朊的，有的兩者兼?zhèn)?，有的兩者皆否，發(fā)酵糖，多元醇、氨基酸、有機酸、嘌呤和其他有機化合物。有些種固定N，都不還原 硫

20、酸鹽。雖然有些種可在大氣壓下，在存在空氣的情況下生長，但絕大多數(shù)菌株是嚴格厭氧的。一般不產(chǎn)生接觸酶，即使產(chǎn)生，數(shù)量也少。5芽孢乳桿菌屬細胞直桿狀，0.7-0.83-5微米，單個、成對、很少呈短鏈，僅為數(shù)不多的長周生鞭毛運動。形成內(nèi)生孢子。革蘭氏陽性。有機化能營養(yǎng)，發(fā)酵代謝己糖是通過僅僅產(chǎn)生乳酸的典型的同型發(fā)酵途徑。不含有血紅素化合物，如接觸酶或細胞色素。微好氧。3 細菌的生理生化試驗：【表5 】細菌的生理生化試驗結(jié)果記錄（注：“+”表示在淀粉水解試驗、油脂水解試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗中呈陽性以及在葡萄糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗中產(chǎn)酸或產(chǎn)氣；“-”表示在淀粉水解試驗、油脂水解試驗、甲基紅試驗、吲

21、哚試驗中呈陰性以及在葡萄糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗中不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）細菌編號淀粉水解試驗油脂水解試驗葡萄糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗吲哚試驗1-+-+-2-3-+-+-4-5+-+-+-空白-5. 霉菌的形態(tài)觀察：（1） 形態(tài)特征：【表6】霉菌形態(tài)特征霉菌編號形態(tài)特征1，2菌絲有隔，分生孢子梗亦有隔，頂端不膨大，無頂囊，其分生孢子梗多次分枝，產(chǎn)生對稱或不對稱的小梗，小頂端有孢子，形如掃帚，稱為帚狀體。（2） 圖片： 【圖23】1號霉菌（1040） 【圖24】2號霉菌（1040） 【圖25】1號霉菌孢子梗 【圖26】2號霉菌孢子梗（3） 對照霉菌圖譜，得知：1號菌和2號菌均屬于青霉屬。七、附：本實驗用到的各種培養(yǎng)基配方。（注：半固體培養(yǎng)基中瓊脂用量減半）1. 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏 1.5g蛋白胨 5gNaCl 2.5g瓊脂 10g水 500mLpH 7.07.2121C滅菌20min2.