原生質體融合技術簡介

1、.,原生質體融合,一 原生質體融合 二 原生質體融合的特點 三 原生質體融合的過程 四 原生質體融合的應用,.,一 原生質體融合,定義：原生質體融合就是將兩個親株的細胞壁分別通過酶解作用加以剝除，使其在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質膜包被著的球狀原生質體。然后將兩個親株的原生質體在高滲條件下混合，由聚乙二醇助融，使它們相互凝集，通過細胞質融合接著發(fā)生兩次基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在再生細胞中獲得重組體。,.,一 原生質體融合,原理：兩個具有不同基因型的細胞，采用適宜的水解酶剝離細胞壁后，在融合劑作用下，兩原生質體接觸，融合成為異核體，經(jīng)過繁殖復制進一步核融合，形成雜合二倍體，再經(jīng)過染色體交

2、換產(chǎn)生重組體，達到基因重組的目的，最后對重組體進行生產(chǎn)性能，生理生化和遺傳特性分析。,.,二 原生質體融合的特點,1 雜交頻率較高 由于原生質體沒有細胞壁的障礙，而且在原生質體融合時加入融合促進劑PEG，所以微生物原生質體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交方法。 2 受接合型或致育性的限制較小 由于兩親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利不同種屬間微生物的雜交。另外，出于原生質體融合是和致育性沒有關系的細胞雜交，所以其受接合型或致育性的限制就比較小。 3 重組體種類較多 由于原生質體融合后，兩個親株的整套基因組之間發(fā)生相互接觸有機會發(fā)生多次交換，可以產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的

3、重組體,.,4 遺傳物質的傳遞更為完整 由于原生質體融合是兩個親株的細胞質和細胞核進行類似合二為一的過程，因此，遺傳物質的交換更為完整。 原核微生物中可以得到將兩個或更多個完整的基因組攜帶到起。 5 可以獲得性狀優(yōu)良的重組體 可以與其他的育種方法相結合，將從其他方法獲得的優(yōu)良性狀，通過原生質體融合再組合到一個單菌株中。 6 可以提高育種（篩選）效率 采用溫度、藥物或紫外線照射等處理鈍化一方親株的原生質體，然后再與另一親株的原生質體融合，因此就可以在篩選過程中除去一方親株，從而提高篩選效率。 7 有可能采用產(chǎn)量性狀較高的茵株作為融合親株 由于遺傳標記如營養(yǎng)缺陷型往往影響工業(yè)微生物的某些生物合 成

4、能力，而進行一般基因重組時又必須采用較多的遺傳標記，因 此，勢必使出發(fā)菌株的生產(chǎn)性能下降而影響雜交子代的生產(chǎn)水 平。但由于原生質體融合頻率較高所以采用較少標記或不帶標 記的菌株進行融合這對改良生產(chǎn)菌株性能來說非常有效 。 8 有助于建立工業(yè)微生物的轉化體系,.,三 原生質體融合的過程,親株,甲,乙,原生質體,融合體,酶解,融合,再生,再生,篩選,優(yōu)化,.,遺傳標記親株篩選 原生質體制備 原生質體再生及再生頻率計算 原生質體的融合 異核體檢出 重組體檢出和鑒定 重組體的形態(tài)，生理生化和遺傳分析,.,1 標記菌株的篩選,用于原生質體融合的親本需要攜帶遺傳標記，以便于重組體的檢出。常用營養(yǎng)缺陷型和抗

5、性作為標記，也可以采用熱致死，孢子顏色，菌落形態(tài)作為標記。實際時究竟采用哪種遺傳標記，要根據(jù)實驗目的來確定。如果原生質體融合的目的是為了進行遺傳分析，那么應該采用帶有隱性基因的營養(yǎng)缺陷性或抗性菌株；如果從育種角度進行原生質體融合，由于大多數(shù)營養(yǎng)缺陷性菌株都會影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，所以在選擇營養(yǎng)缺陷性標記時，應盡量避免采用對正常代謝有影響的缺陷性菌株,.,2 原生質體的制備,獲得有活力、去壁較為完全的原生質體是原生質體融合育種技術的先決條件。 在細菌和放線菌中，制備原生質體主要采用溶菌酶；制備葡萄球菌的原生質體，則需用溶葡萄球菌素處理；制備酵母菌的原生質體時， 一般可用蝸牛酶；制備絲狀真菌的原生質

6、體時，可用蝸牛酶，在絲狀真菌的原生質體制備中很少單獨使用一種酶，而是采用兩種或三種酶混合處理。 另外，影響原生質體制備的因素有許多，主要是 菌體的性質 ，酶的性質以及反應環(huán)境,.,(1) 菌體的前處理 為了使酶的作用效果更好一些，可對菌體作一些前處理，主要是在培養(yǎng)基中加入一些物質，加入這些物質的目的，就是使菌體的細胞壁對酶的敏感性增加。例如：青霉素能干擾甘氨酸交聯(lián)橋與四肽側鏈上的D丙氨酸之間的聯(lián)結，使細菌不能合成完整的具有空間網(wǎng)絡結構的細壁，結果使細胞壁結構疏松，便于溶菌酶處理。 (2)菌體的培養(yǎng)時間 微生物能否較好地形成原生質體與微生物的生理狀態(tài)有一定的關系。為了使菌體細胞易于原生質體比，一

7、般選擇對數(shù)生長期的菌體。這時的細胞正在生長，代謝旺盛，細胞壁對酶解作用最為敏感。由其得到的原生質體，形成率高，再生率也很高。,.,(1) 酶濃度 對于不同種屬的微生物來說不僅對酶的種類要求不同，就是酶的濃度也有差異。一般地說，酶濃度增加，原生質體的形成率也增加，超過一定范圍則原生質體形成率的提高不明顯。酶濃度過低，則不利于原生質體的形成；酶濃度過高，則導致原生質體再生率的降低。因此，有人建議以使原生質體形成率和再生率之積達到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。 (2) 酶解溫度 據(jù)報道酶解溫度對原生質體再生的影響很大。因此，在選擇最佳酶解溫度時除了要考慮酶的最適溫度外，還要用原生質體再生率加以校正

8、(3) 酶解時間 酶解時間過短，原生質體形成不完全，結果會影響原生質體間的融合；酶解時間過長，原生質體脫壁太完全，原生質體的質膜也易受到損傷，從而影響原生質體的再生，最終也不利于原生質體融合。因此，為了使融合實驗得以成功，必須要選擇合適的酶解時間才行。,.,(1)滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質體制備中，不僅起到保護原生質體免于膨脹作用，還有助于酶和底物的結合。滲透壓穩(wěn)定劑多采用Kcl、NaCl等無機物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸鈉等有機物。菌株不同，最佳穩(wěn)定劑也有差異，在細菌中多用蔗糖，丁二酸鈉、NaCl等；在酵母菌中多用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。穩(wěn)定劑的使用濃度一般

9、均在o3一o8mol/L之間。 除此以外，破壁時的pH值、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、離子強度和種類等對原生質體的形成也有一定的影響。,.,3 原生質體的再生,酶解去壁后得到的原生質體應具有再生能力，即能重建細胞壁，恢復細胞完整形態(tài)并能生長、分裂，這是原生質體融合育種的必要條件。僅有細胞質膜的原生質體對滲透壓很敏感、很容易破裂，致使原生質外流而使細胞死亡。所以，再生培養(yǎng)基必須與原生質體內(nèi)的滲透壓相等。這就要在再生培養(yǎng)基中加入具有一定滲透壓的基質，即滲透壓穩(wěn)定劑 原生質體的再生是一個非常復雜的過程一些學者研究認為，若原生質體的細胞壁剝?nèi)サ貌惶珡氐?，則有助于細胞壁的再生，殘留的細胞壁尤如結晶時的“晶種”

10、一樣。大量實驗也證明，破壁太徹底往往會引起原牛質體再生率的大大降低,.,在進行融合實驗前，般先要對原生質體再生率進行測定，否則就很難確定不能融合或融合頻率低是由于雙親原生質休本來就沒有活性或再生率很低，還是由于融合條件不適合所致。因此，測定原生質體形成率和再生率不僅可作為檢查、改善原生質體形成和再生條件的指標，而且也是分析融合實驗結果，改善融合條件的一個重要指標。原生質體再生率的計算公式： 原生質體再生率（再生平板菌數(shù)-低滲剩余菌數(shù)）/（破壁前菌數(shù)-低滲剩余菌數(shù)） 一般地說，原生質體的再生率常常只有百分之幾到百分之幾十，各的甚至可達100。如果原生質體不能恢復成原來菌的正常狀態(tài)，那么微生物的原

11、生質體在遺傳操縱工作方面的應用將是不可能的。,.,4 原生質體的融合,僅僅將原生質體等量地混合在 一起融合頻率仍然很低，只有加入表面活性劑聚乙二醇(PEG)，融合頻率才會提高，常用的PEG是相對分子量為4000和6000的兩種。 在原生質體融合過程中，除了要加入PEG外，還要加入鈣鎂等陽離子，它們對融合也有促進作用。在有鈣離子存在的條件下融合時pH值為堿性能刺激產(chǎn)生最大的融合頻率，這是因為PH能夠改變體系的電性狀態(tài)，從而影響原生質體的融合。 由于PEG既是融合劑又是滲透壓穩(wěn)定劑，濃度低于 20會使原生質體破裂而失去穩(wěn)定性，濃度過高又會引起原生質體收縮而降低融合頻率，因此，融合時PEG的最終濃度

12、常采用30%一40。由干PEG一加入，原生質體間的粘著即？強烈地發(fā)生，融合就能較長時間有效地進行，所以PEG的處理時間不得太長。此外，PEG在高濃度下有毒，因此也要求融合時間不宜過長。 有人指出，先用紫外線照時原生質體，再進行融合可以大大增加融合頻率,.,另外，利用物理因子也可以促進細胞融合，主要是電融合技術 。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實現(xiàn)原生質體的融合，從而改變了化學融合(指用PEG融合)的隨機過程。同時其融合頻率高，操作簡便、快速，對細胞損傷較小，并可以在顯微鏡下進行。,.,5融合子的選擇,原生質體融合后，重組子即融合子的選擇方法是使原生質體融合技術得以應用的關鍵。按照sc

13、haeffer的觀點，有兩個遺傳標記互補就可以確定其為融合子。因此，就可以通過那些選擇性遺傳標記，在選擇培養(yǎng)基上挑出融合子。但是，由于原生質體融合后會產(chǎn)生兩種情況，一種是真正的融合，即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可以在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定而后一種則是不穩(wěn)定的，會分離成親本類型，有的甚至可以以異核狀態(tài)移接幾代。因此要獲得真正融合子，必須在融合原生質體再生后，進行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。 常用的融合子篩選方法有兩種：直接法,間接法和鈍化選擇法,.,(1)直接法 原生質體融合后直接分離到MM或SM上，即可直接檢出融合細胞。其優(yōu)點是只需一步就

14、可得到重組體，而大多數(shù)重組體是穩(wěn)定的，缺點是難以檢出那些表型延遲而基因已重組的融合體。 (2)間接法 把融合產(chǎn)物分離到CM上，使原生質體再生，融合和非融合的原生質體都能生長，再分離到SM上。其優(yōu)點是能促使細胞更好地再生，表型延遲重組體容易檢出。缺點是需要兩步才能檢出重組體，需要相當大的人力和物力，而且得到的重組體不大穩(wěn)定。 直接法和間接法都要用營養(yǎng)缺陷性標記，所得重組體不一定能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。 (3)鈍化選擇法 鈍化選擇法是指滅活原生質體和具活性原生質體融合，把親株中的一方（野生型）原生質體在50C熱處理2-3小時，使融合前原生質體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生，再與另一方（雙缺陷性）原生

15、質體融合，并分離到mm上，滅活除用加熱方法外，還可以用紫外或藥物處理。,.,6 實用性菌株的篩選,微生物原生質融合是一種新的基因重組技術，它具有定向育種的含義。但是，融合后所產(chǎn)生的融合子類型仍然是各種各樣的。性能不同，產(chǎn)量不同的情況仍然存在，因此必要的人工篩選仍然很重要 ，主要是遺傳穩(wěn)定性等的實驗。,.,四 原生質體融合育種的應用,陳寧等以球形芽抱桿菌和蘇云金芽泡桿菌H4為親株(前者對淡色庫蚊有高毒力，后者對粘蟲、玉米螟有高毒力)，在23 mg/ml溶菌酶濃度下，42C酶解45分鐘，獲得了原生質體，其原生質體形成率和再生率分別為91.2、37.6及93.3、31.2，然后將獲得的原生質體以l:1比例混合，加入40的PEG于42C保溫