GB 5009.210-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定

016 前 言本標(biāo)準(zhǔn)代替008食品中泛酸的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)與008相比,主要變化如下:標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定”;增加了高效液相色譜方法;修改了食品的前處理方法;增加了檢出限和定量限。0161 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中泛酸和泛酸鈣的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中泛酸的測(cè)定,第二法適用于營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑類保健食品和配方食品中泛酸(鈣)的測(cè)定。第一法 微生物法2 原理泛酸是植物乳桿菌長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素,在一定控制條件下,將植物乳桿菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)液中,培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定透光率(或吸光度值),根據(jù)泛酸含量與透光率(或吸光度值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣中泛酸的含量。3 試劑和材料除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的二級(jí)水。酸(乙酸(氧化鈉(化鈉(酸鈉(酸氫鉀(酸氫二鉀(水合乙酸鈉(水合磷酸二氫鉀(水合硫酸鎂(水合硫酸亞鐵(水合硫酸錳(2O)。羥甲基氨基甲烷(萄糖(苯(水乙醇(離子交換樹脂:粒度38m75m。0162 性磷酸酶:酶活力23U/g。子肝臟丙酮提取物干粉(酶活力g。白胨:含氮量10%。母提取物:含氮量10%。脂。酸溶液():水稀釋至1000勻。酸鈉溶液():水溶解并稀釋至1000勻。酸溶液(1):吸取83水稀釋至1000勻。酸浸泡液:吸取100 氫氧化鈉溶液(1):稱取40水溶解并稀釋至1000勻。氧化鈉溶液():稱取4水溶解并稀釋至1000勻。水至1000勻。貯存于24冰箱中,可保存2周。理鹽水:稱取9水溶解并稀釋至1000勻。臨用前預(yù)先滅菌,于121高壓滅菌10 乙醇溶液(20%):量取2000 碳酸鈉溶液():水溶解并稀釋至1000勻。酸氫鉀溶液():稱取2水溶解并稀釋至1000勻。性磷酸酶溶液:稱取2水溶解并稀釋至100用現(xiàn)配,24冰箱預(yù)冷?；?稱取100于錐形瓶中,加入1于振蕩器上充分振搖10鋪有濾紙的布氏漏斗過(guò)濾。轉(zhuǎn)回錐形瓶,再加入1濾。加入1濾,重復(fù)用水洗滌10次。逐滴加入4冰箱保存,2天內(nèi)用完。子肝臟提取液:配制此試劑前一天將所用容器放入24冰箱中冷藏過(guò)夜。稱取30入研缽中,冰浴條件下分兩次加入300入具塞離心管中,蓋好塞后充分振搖,凍10上清液轉(zhuǎn)至500150,放入冰浴中混勻5混合液倒入離心管中,3000r/上清液移入另一50020冷凍10加150,放入冰浴中混勻5混合液倒入離心管中,3000r/上清液分裝于具塞試管中(每管大約3凍保存。用前于24冰箱內(nèi)化凍并保存至用時(shí)。鹽溶液:分別稱取25水溶解并稀釋至500勻。加入14冰箱可保存1年。鹽溶液:分別稱取10水溶解并稀釋至5005滴鹽酸,24冰箱可保存1年。脂培養(yǎng)基:按表1稱取或吸取各試劑,加水至100合,沸水浴加熱至瓊脂完全溶化。趁熱用1鹽酸溶液和/或1快分裝,根據(jù)試管內(nèi)徑粗細(xì)加入3面高度不得低于2上棉塞,121高壓滅菌150163 置,待冷卻后于冰箱內(nèi)保存,備用。表1 酸測(cè)定用培養(yǎng)液:可按附錄可直接由試劑公司購(gòu)買效力相當(dāng)?shù)姆核釡y(cè)定用培養(yǎng)基,用前按說(shuō)明書配制。準(zhǔn)品18純度99%。酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(水溶解并轉(zhuǎn)移至10001000水定容至刻度。儲(chǔ)存于棕色瓶中,加入3滴5滴甲苯,于24冰箱中可保存2年。酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(入1000水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯于24冰箱中可保存1年。酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(20ng/水定容至刻度,混勻。臨用前現(xiàn)配。4 平:溫培養(yǎng)箱:371。力蒸汽消毒器:121。渦振蕩器。心機(jī):轉(zhuǎn)速3000r/種針和接種環(huán)。4.7 度外凈工作臺(tái)。聲振蕩器。0164 5 種植物乳桿菌備菌種的制備將菌種植物乳桿菌接至瓊脂培養(yǎng)基中,在371恒溫箱中培養(yǎng)20h24h,連續(xù)傳種2次3次。取出后放入24冰箱作為儲(chǔ)備菌株保存。每月至少傳代一次,不宜超過(guò)25代。試驗(yàn)前將儲(chǔ)備菌株接種至瓊脂培養(yǎng)基中,371恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24于接種液的制備。注:保存數(shù)周以上的儲(chǔ)備菌株,不能立即用作接種液制備,試驗(yàn)前宜連續(xù)傳種2代3代以保證細(xì)菌活力。種液的制備試驗(yàn)前一天,取2裝于2支5好棉塞,于121高壓滅菌15卻后用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)種至2支種子培養(yǎng)液中,于371恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h24h。取出后3000r/上清液,無(wú)菌操作下用已預(yù)先滅菌的生理鹽水淋洗2次,3000r/上清液。再加入3蕩混勻,制成接種液,立即使用。6 分析步驟注:樣制備谷薯類、豆類、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過(guò)篩(肉、蛋、堅(jiān)果等用勻質(zhì)器制成食糜;果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻;液體試樣用前振搖混合。4冰箱可保存1周。接提取法形態(tài)為顆粒、粉末、片劑、液體的營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑或強(qiáng)化劑、預(yù)混料,添加了泛酸鈣的配方食品或保健食品可采用直接提取法。準(zhǔn)確稱取適量試樣(m),g;液態(tài)試樣5g10g,入100入80塞,超聲振搖提取4水定容至1001)。解法一般谷薯類、肉蛋乳類、果蔬菌藻類、豆及堅(jiān)果類等食品試樣宜采用酶解提取法。解:準(zhǔn)確稱取適量試樣(m,般谷薯類、肉類、蛋類、豆類及其制品稱取1g5g;新鮮果蔬、乳及其制品稱取5g10g。轉(zhuǎn)入至100100蕩混勻。于121高壓條件下水解15卻至室溫,0165 至100水定容至刻度(過(guò)濾。解:準(zhǔn)確吸取適量試樣濾液(2)至25水至105冰浴條件下,心混勻試管,避免混合物黏附于試管壁,加1滴甲苯,371溫箱中溫育過(guò)夜(8加水至203),過(guò)濾。調(diào)節(jié)取適量的試樣酶解液(4)于25水至205)。另取一試管加入5法加入碳酸氫鈉溶液、堿性磷酸酶溶液、鴿子肝臟提取液酶液及溫育過(guò)夜,:以谷物、乳粉等為基質(zhì)的配方食品如需計(jì)量基質(zhì)本底泛酸含量,可采用酶解法提取。釋根據(jù)試樣中泛酸含量用水對(duì)試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋(F),使稀釋后試樣提取液中泛酸濃度約為20ng/定系列管制備所用試管使用前洗刷干凈,用水煮沸30干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2h,經(jīng)170烘3 試樣和酶空白系列管取4支試管,x),勻。 當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列管中泛酸含量為000000000000勻。為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系,應(yīng)制備2套3套標(biāo)準(zhǔn)系列管,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的均值計(jì)算。菌將所有測(cè)定管塞好棉塞,于121高壓滅菌15種和培養(yǎng)待測(cè)定系列管冷卻至室溫后,在無(wú)菌操作條件下向每支測(cè)定管滴加接種液50L。塞好棉塞,置于371恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h20h,直至達(dá)到最大混濁度,即再培養(yǎng)2吸光度值)無(wú)明顯變化。另準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管(含0接種作為0對(duì)照管。定將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管用漩渦混勻器混勻。用厚度為1550未接種的0對(duì)照管調(diào)節(jié)透光率為100%(或吸光度值為0),依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0對(duì)照管有明顯的細(xì)菌增長(zhǎng),或者與0對(duì)照管相比,標(biāo)準(zhǔn)0管透光率在90%以下(或標(biāo)準(zhǔn)系列管透光率最大變化量40%(0166 化量說(shuō)明可能有雜菌或不明來(lái)源的泛酸混入,需重做試驗(yàn)。注:泛酸測(cè)定適宜的光譜范圍54060準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)系列管泛酸含量為橫坐標(biāo),每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)透光率(或吸光度值)均值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣結(jié)果計(jì)算:從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣和酶空白系列管中泛酸的相應(yīng)含量(x),如果每個(gè)試樣的4支試樣系列管中有3支以上泛酸含量在100按照式(1)計(jì)算每毫升試樣稀釋液中泛酸濃度(),各管之間相對(duì)偏差小于15%,則可繼續(xù)按式(2)或式(3)式(5)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算,否則需重新取樣測(cè)定。試樣稀釋液中泛酸濃度按式(1)計(jì)算:=(1)式中: 試樣稀釋液中泛酸濃度,單位為納克每毫升(ng/x從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得測(cè)定系列管中泛酸含量,單位為納克(制備試樣系列管時(shí)吸取的試樣稀釋液體積,單位為毫升(采用直接提取法的試樣中泛酸含量按式(2)計(jì)算:X=m100106(2)式中:X 試樣中泛酸含量,固態(tài)試樣單位為毫克每百克(00g),液態(tài)試樣為毫克每百毫升(00試樣稀釋液泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣提取液的定容體積,單位為毫升(F試樣提取液稀釋倍數(shù);m試樣質(zhì)量,單位為克(g);100106換算系數(shù)。采用酶解法的試樣中泛酸含量按式(3)式(5)計(jì)算:025(3)3(4)X=(2100106(5)式中:酶空白液中泛酸含量,單位為納克(0酶空白液中泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/25酶空白液總體積,單位為毫升(試樣酶解液中泛酸含量,單位為納克(試樣稀釋液泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣調(diào)位為毫升(試樣酶解液的定容體積,單位為毫升(0167 F試樣提取液稀釋倍數(shù);試樣調(diào)位為毫升(X 試樣中泛酸含量,固態(tài)試樣單位為毫克每百克(00g),液態(tài)試樣為毫克每百毫升(00試樣水解液的定容體積,單位為毫升(m試樣質(zhì)量,單位為克(g);試樣酶解時(shí)吸取的水解液體積,單位為毫升(100106換算系數(shù)。結(jié)果如以泛酸鈣計(jì)量,算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度一般食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%;營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑和強(qiáng)化食品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的5%。8 其他一般食品稱樣量為500g,00g。營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑類保健食品和配方食品稱樣量為200g,00g。第二法 高效液相色譜法9 原理利用泛酸易溶于水,在弱酸性至中性條件下(定的理化性質(zhì),試樣用熱水在超聲波振蕩下提取,經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)200據(jù)色譜峰的保留時(shí)間及紫外光譜圖定性,外標(biāo)法定量,計(jì)算試樣中泛酸含量。10 試劑和材料除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規(guī)定的一級(jí)水。酸(酸(酸二氫鉀(色譜純。水合硫酸鋅(腈(色譜純。粉酶:酶活力0168 酸():水稀釋定容至刻度,混勻。酸鋅溶液():水溶解并定容至100酸二氫鉀溶液():500水定容至1000酸標(biāo)準(zhǔn)溶液注:18純度99%。酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(水溶解并轉(zhuǎn)入1000容至刻度,混勻(4冰箱中可保存5d)。酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(水定容至刻度。臨用前配制。酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:水定容至刻度,用前配制。11 平:箱培養(yǎng)箱:555。聲波振蕩器。11.4 度效液相色譜儀:帶紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。12 樣制備固態(tài)試樣粉碎并混合均勻;碳酸飲料需超聲波去除二氧化碳,其他液態(tài)試樣搖勻。養(yǎng)素補(bǔ)充劑類保健食品準(zhǔn)確稱取或量取適量試樣(m),g,液態(tài)試樣10g20g,置于50入約3050溫水超聲提取20水定容至刻度(V)。轉(zhuǎn)入離心管3000r/0液待上機(jī)測(cè)定。方食品準(zhǔn)確稱取適量試樣(m),般固態(tài)試樣約5g,液態(tài)試樣約20g。置于100入4050溫水至30果試樣中含有淀粉,搖混勻,蓋上瓶塞,在555水浴條件下,振搖酶解12040果試樣不含淀粉,直接超聲提取20出試樣液,冷卻至室溫,硫酸鋅溶液,充分混合。轉(zhuǎn)入50水定容至刻度并充分混勻后,轉(zhuǎn)入離心管3000r/0169 50液待上機(jī)測(cè)定。釋必要時(shí),試樣測(cè)定液用水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?F),使試樣測(cè)定液中泛酸濃度在1g/2g/譜柱:徑5m,250具有同等性能的色譜柱。溫:28外檢測(cè)器:檢測(cè)波長(zhǎng):210動(dòng)相:磷酸二氫鉀溶液+乙腈=95+5。速:樣量:10準(zhǔn)曲線測(cè)定按照已經(jīng)確立的色譜條件,將泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)行色譜分析(標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見附錄B),記錄標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間、色譜峰高(或峰面積)。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo),峰高(或峰面積)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣溶液的測(cè)定取試樣測(cè)定液按照色譜條件進(jìn)行色譜分析,根據(jù)試樣峰高(或峰面積)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的泛酸濃度()。13 分析結(jié)果的表述試樣中泛酸的含量按式(6)計(jì)算:X=V001000(6)式中:X 試樣中泛酸含量,固態(tài)試樣單位為毫克每百克(00g),液態(tài)試樣為毫克每百毫升(00從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣測(cè)定液中泛酸的濃度,單位為微克每毫升(g/V試樣測(cè)定液總體積,單位為毫升(F試樣測(cè)定液稀釋倍數(shù);m試樣質(zhì)量,單位為克(g);1001000換算系數(shù)。結(jié)果如以泛酸鈣計(jì)量,算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。01610 14 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的5%。15 其他當(dāng)稱樣量為500g,00g。01611 附 錄 酸(氧化鈉(性炭: 甲苯(酸腺嘌呤(2酸鳥嘌呤( 尿嘧啶(611黃素(酸硫胺素(物素(酸(液:。氨基苯甲酸(克酸(酸吡哆醇(水乙醇(醇溶液(1+3)。山梨酯溫水葡萄糖(水合乙酸鈉(維生素酪蛋白(氧化鈉溶液(10):稱取40100 氫氧化鈉溶液(1):稱取4100 鹽酸溶液(3):吸取250水稀釋至1000勻。酸溶液(1): 酪蛋白液:稱取50200),于121高壓水解6h。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi),在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200此反復(fù)3次,以除去鹽酸。用1020搖約20濾。重復(fù)活性炭處理2次4次,直至濾液呈淡黃色或無(wú)色。濾液加水稀釋至1000324冰箱中可保存1年。注:每次蒸發(fā)時(shí)不可蒸干或焦糊,以避免所含營(yíng)養(yǎng)素破壞?？芍苯佑稍噭┕举?gòu)買效力相當(dāng)?shù)乃崴鉄o(wú)維生素酪蛋白。01612 嘌呤別稱取硫酸腺嘌呤、75熱使其完全溶解后冷卻。若有沉淀產(chǎn)生,再加鹽酸數(shù)滴,加熱,如此反復(fù)直至冷卻后無(wú)沉淀產(chǎn)生為止。用水稀釋至1003滴5滴甲苯,貯存于棕色試劑瓶中,置24冰箱中可保存1年。氨酸別稱取4熱至7080,逐滴加入3鹽酸溶液,不斷攪拌,直至完全溶解為止