醫(yī)學課件沉默net1基因對肝癌細胞生物學行為的影響

沉默NET-1基因 對肝癌細胞生物學行為的影響 v肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是全球性 的健康問題之一。我們南通啟東是WHO確定的HCC高發(fā)研究 現場。 v研究基于我們的首次發(fā)現NET-1在HCC組織中特定表達，并 發(fā)現該基因參與HCC細胞的分裂增殖和癌發(fā)生、發(fā)展密切相 關的細胞運動過程,探討針對NET-1的siRNA抑制肝癌癌細胞 株(SMMC-7721)中NET-1基因的表達，及該基因對癌細胞增 殖、遷移、內吞的影響。 一、項目研究背景 NET-1與NET-2到NET-7一起統稱為NET-X，它們是由Serru等于 2000年在EST 數據庫中發(fā)現的7 個新的含4 次跨膜蛋白超家 族( transmembrane 4 superfamily 或tetraspan family, 簡稱TM4SF) 的成員。 NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色體1p34.1上，其 mRNA全長為1297bp(基因庫登記號 碼AF065388)，為TM4SF的成員之一 ，最近證實其為腫瘤相關基因。 1、NET-1siRNA表達質粒和myc-NET-1重組表達質粒 的構建 。 2、細胞培養(yǎng)與轉染。 3、細胞內總RNA抽提及RT-QPCR檢測NET-1m RNA 。 4、Western blot檢測NET-1蛋白表達。 5、CCK-8法檢測細胞增殖活性。 6、流式細胞儀(FCN)檢測各組細胞處于不同細胞周期 中的比例與增殖指數。 7、細胞劃痕試驗檢測細胞二圍空間的遷移能力。 8、Transwell小室檢測細胞三圍空間的遷移能力。 9、Capture-ELISA方法測量細胞內生物素標記的轉鐵 蛋白水平。 10、 anti-uPAR標記的癌細胞偽足形成實驗。 一、 材料與方法 系統 組織 成人組織 胎兒組織 惡性組織 第一組 第二組 第三組 消化系統 胃 + NA* + 食道 + NA NA 小腸 + NA NA 結腸 + NA NA 直腸 + NA + 胰腺 NA + 肝 + 泌尿生殖系統 腎 + + + 睪丸 + + + 宮頸 + NA (halan 細胞l) + 宮體 + NA + 前列腺 + NA NA 乳腺 + NA NA 內分泌系統 垂體 + NA NA 甲狀腺 + NA NA 腎上腺 + NA NA 淋巴造血系統 造血細胞 NA * 淋巴結 + NA NA 骨髓 NA NA 脾臟 + NA NA 胸腺 + NA NA 神經系統 腦 + + NA 脊髓 + NA NA 視網膜 + NA NA 其他 心 + 黑色素瘤 + 肺 + + NA 肌肉 + + NA 皮膚 + + NA 胎盤 + NA NA *NA:現在未做檢測； *白血病，淋巴瘤 1. 檢測人體組織中 NET-1mRNA表達 鎖定研究目標 HCC 二、結果 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Lanes M: 200ng of 1kb size ladder (New England BioLabs); Lanes1-3: Normal Fetal Liver Tissues; Lanes 4- 7: Normal Adult Liver Tissues; Lanes 8 -11: Liver Cancer Tissues 轉染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721細胞中NET-1mRNA的表達（ RT-QPCR） 以未處理組為1。NET-1-siRNA組和myc-NET-1組分別與未處理組相比 (P0.05） NET-1 siRNA處理細 胞后遷移能力明顯下 降。 轉染48h后穿過Matrigel膠細胞數NET-1 siRNA組（ 21.425.74）和pU6H1-GFP（45.608.25）差異有顯著統 計學意義（P0.05）；myc-NET-1組（64.806.14）和 pcDNA3.1/myc（38.207.22）差異有顯著統計學意義（ P0.05）。 6. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞內吞 轉鐵蛋白(Tfn)內吞實驗顯示，NET-1 siRNA組癌細胞 的內吞能力明顯下降。其他組間的內吞作用變化不明 顯 。 未處理 anti-NET-1 兔IgG NET-1siRNA GFP-siRNA 7. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞侵襲偽足形成 NET-1siRNA處理細胞偽 足形成細胞百分比明顯 減少(p0.01) NET-1siRNA處理 細胞中以anti- uPAR標記的癌細 胞偽足明顯減少 。 8.干擾NET-1 可以抑制裸鼠HCC的生長 myc-NET-1 NET -1 siRNA 9.NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后的研究 (1) NET-1表達與HCC臨床病理因素 密切相關。 NET-1基因蛋白表達與HCC臨床病理因素的關系(76例) （2）Kaplan-Meier生存曲線 （3）Cox比例風險模型多因素生存分析 HCC轉移、組織學分級，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表達均具有獨 立的預后意義。 風險分析提示這些因素增強時均能增加HCC病人的死亡風險(其風險比均1) 三、討論 本文通過構建NET-1siRNA和myc-NET-1表達質粒，并 轉染肝癌細胞SMMC-7721。研究發(fā)現NET-1基因參與肝癌 細胞的增殖分裂活動，干擾肝癌細胞NET-1基因的表達， 可以抑制癌細胞的增殖，使細胞生長受限，可以抑制細胞 在二圍、三圍空間的遷移能力、癌細胞內吞能力和侵襲性 偽足形成能力。相反，增加NET-1基因的表達，癌細胞表 現為顯著增生，更快地進入細胞周期，遷移能力提高。研 究結果揭示了肝癌細胞中NET-1基因的功能，為肝癌的發(fā) 生、發(fā)展機制增添了新的內容。 NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后相關性的研究 顯示為NET-1表達與HCC的組織學分型、病理分級、脈管 轉移等臨床病理因素密切相關。癌中NET-1高表達患者生 存期明顯減少、 NET-1高表達具有獨立的預后意義。 NET- 1 高表達能增加HCC病人的死亡風險。 1.首次發(fā)現NET-1在肝臟良惡性組織中表達的特點。 2.在HCC細胞中干擾NET-1表達，抑制癌細胞的遷移、 侵襲、內吞和偽足形成的能力，并能抑制裸鼠HCC 生長。提示NET-1可能在HCC細胞運動中發(fā)揮作用， 是HCC細胞增殖相關蛋白。 3.NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關，是顯著影 響患者預后的獨立指標，高表達患者死亡風險增加，具 有顯著的臨床預后評估價值。 4.已研制的NET-1多克隆抗體，可用于免疫組化、蛋白 印跡等多種實驗，具有臨床推廣使用的可行性與價值 。 四、項目研究創(chuàng)新點 致 謝 1、該