《熒光原位雜交更》PPT課件.ppt

熒光原位雜交技術(shù),簡 介,原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH） Gall和Pardue 1969年建立。 用標(biāo)記的DNA或RNA作為探針，對組織細(xì)胞內(nèi)的核酸或有絲分裂中期的染色體進行原位檢測和觀察。 最初的探針大多以同位素3H、32P等標(biāo)記，但因同位素標(biāo)記探針對人體有放射損害、實驗周期長、放射自顯影的分辨率有限、環(huán)境污染等缺點，給研究及實際應(yīng)用帶來了諸多不便。,熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization ，F(xiàn)ISH） 利用熒光物質(zhì)標(biāo)記探針（直接或間接），再進行雜交，可通過熒光顯微鏡對靶序列進行定性、定位和定量分析 FISH技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)證實或發(fā)現(xiàn)了用經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)方法無法證實或發(fā)現(xiàn)的腫瘤染色體改變，成為銜接細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)之間的一座橋梁。開創(chuàng)了一個新的學(xué)科分子細(xì)胞遺傳學(xué)。,雜交流程,a.兩要素： 探針和靶序列 b.標(biāo)記探針 直接標(biāo)記和間接標(biāo)記 c.變性 探針和靶序列成為單鏈 d.混合雜交 e.間接標(biāo)記的探針需連接熒光基團的步驟,F I S H,熒光原位雜交特點,與其它原位雜交技術(shù)相比，F(xiàn)ISH的優(yōu)點： 經(jīng)濟安全，快速方便； 敏感性高，特異性強，背景低； 宜于多靶雜交，對同一標(biāo)本同時進行多個探針雜交，不同的探針可以顯示不同的熒光顏色； 使用G帶玻片可作出回顧性分析； 缺點： 不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降。,基因特異探針靶向每條染色體只有一個拷貝的DNA序列。 主要用于間期或中期染色體中識別染色體易位、倒位、重復(fù)和缺失、鄰近基因綜合征、標(biāo)記染色體和染色體擴增等，可檢測基因的擴增和重排。,常用探針類型 基因特異探針,常用探針類型 重復(fù)序列探針,重復(fù)序列探針的結(jié)合位點是基因組中多拷貝的短重復(fù)堿基對序列（例如著絲粒和端粒探針）所在的染色體區(qū)域。 著絲粒常常是A-T豐富區(qū)，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重復(fù)序列相對容易制備和分辨率較高（0.5Mb），這種FISH被普遍用于篩查一般的染色體非整倍體、亞端粒缺失和標(biāo)記染色體。,21三體FISH,常用探針類型 WCP探針,全基因組繪畫（WCP）探針是一種復(fù)合DNA探針。除著絲粒和端粒區(qū)外，全基因組繪畫探針對全長染色體有高度親和力。這些探針最適用于識別中期染色體的基因組不平衡，尤其是在許多癌癥中觀察到的復(fù)雜染色體重排。 M-FISH用特殊選擇的窄帶濾色片連續(xù)捕獲5種熒光色素中的每一種熒光色素圖像；SKY用于熒光色素組合分析的成像設(shè)備不同：冷電荷耦合器(CCD)照相機和Fourier變換光譜法相結(jié)合，同步曝光成像。 這些技術(shù)目前在國內(nèi)一些重點細(xì)胞遺傳學(xué)實驗室中開展。,WCP探針（SKY）,技術(shù)結(jié)合產(chǎn)前BoBS,BACs是人類DNA的長片段克隆序列，典型的150-170kbp，相對于短的DNA探針具有更好的信噪比、不受DNA質(zhì)量影響、更高的覆蓋率。 將BAC DNA探針耦聯(lián)至Luminex xMAP熒光編碼的微球上，將FISH技術(shù)與Luminex技術(shù)平臺結(jié)合，BACs-on-Beads技術(shù)可以在同一個微孔內(nèi)實現(xiàn)多個FISH探針的檢測，相對于同時進行成百上千次FISH實驗。 高通量、標(biāo)本來源廣、快速、結(jié)果明確；除了檢測13，18，21，X，Y染色體拷貝數(shù)目的變化外，還可檢測9種常見的微缺失綜合征。,技術(shù)結(jié)合 FQ-PCR,來自于分子生物學(xué)技術(shù)-定量熒光聚合酶鏈反應(yīng) 和FISH的結(jié)合； 對染色體13、18、21、X和Y采用熒光引物對染色體特異性高度多態(tài)性DNA短重復(fù)序列進行PCR擴增，快速診斷非整倍體；特定的基因引物可以檢測基因的缺失與擴增 檢測“有”或“無”和數(shù)目異常；位置異常無法判斷，如平衡性染色體重排。,幾種技術(shù)平臺比較,細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的比較,FISH相關(guān)項目,羊水細(xì)胞熒光原位雜交分析（包括未培養(yǎng)和培養(yǎng)） 血細(xì)胞熒光原位雜交分析 其他各類細(xì)胞熒光原位雜交分析 SRY等單基因分析 胚胎染色體病診斷（PGD）,結(jié)合技術(shù)相關(guān)檢測項目,染色體病快速產(chǎn)前診斷（FISH、qPCR、BoBs） 產(chǎn)前單基因病診斷 SNP Array 檢測 某些代謝病的產(chǎn)前診斷,項目意義,1.快速且準(zhǔn)確進行檢測 較羊水染色體分析，F(xiàn)ISH技術(shù)可以確定13、18、21、X、Y的染色體數(shù)目信息，緩解唐篩陽性患者或高齡孕婦精神負(fù)擔(dān)；緩解醫(yī)生核型分析工作壓力，能夠有針對性的對樣本進行處理。 2.彌補核型檢測失敗無報告的問題 FISH對于樣本要求比較低，對于羊水量少、羊水活細(xì)胞數(shù)目少、孕周偏大、細(xì)胞培養(yǎng)失敗、核型結(jié)果難以判讀等各種原因?qū)е碌暮诵头治鍪【舍槍π缘慕o予彌補，解決占染色體數(shù)目異常的80-90%問題。 3.FISH與羊水染色體核型分析構(gòu)成較為完整的染色體異常診斷平臺，提高了產(chǎn)科胎兒產(chǎn)前診斷水平。 4.BoBs可檢測9種常見的微缺失綜合征，拓寬了檢測范圍。,工作基礎(chǔ),探針 商品化探針 原位雜交儀 Luminex xMAP 液相芯片檢測平臺,工作基礎(chǔ),工作人員 1）項目負(fù)責(zé)人 劉紅衛(wèi)，男，婦產(chǎn)科實驗室技術(shù)負(fù)