全自動生化分析儀的常用檢測方法課件

,生化分析儀的常用檢測方法 董蘋 2010-8,內(nèi)容,一 概述 二 基本原理 終點法 三 檢測方法 固定時間法 連續(xù)監(jiān)測法,功能特點,特點：自動化機械化的儀器設(shè)備模仿 代替手工操作 優(yōu)點：提高了工作效率 減少了主觀誤差 靈敏 準(zhǔn)確 快速 標(biāo)準(zhǔn)化,分類,管道連續(xù)流動式 按結(jié)構(gòu)原理分 分立式常用 離心式 干片式急診常用 小型 按測定速度分 中型 大型 超大型（模塊式） 按自動化程度分 半自動 全自動,主要構(gòu)成,加樣系統(tǒng)（樣品轉(zhuǎn)盤 試劑倉 取樣裝置） 比色系統(tǒng)（光源 比色杯 單色器 檢測器） 供排水系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),內(nèi)容,一 概述 二 基本原理 終點法 三 檢測方法 固定時間法 連續(xù)監(jiān)測法,光吸收曲線,溶液對不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。,討論,不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似max不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同。 不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度 A 不同，在max處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。,在分光光度法中, 以_為縱坐標(biāo), 以 _為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。 濃度不同的同種溶液, 在該種曲線中其最 大吸收波長_，相應(yīng)的吸光度大小 則_，同一波長下摩爾吸數(shù) 。,波長,不同,相同,吸光度,相同,Lamber-Beer定律：吸收光譜法基本定律,描述物質(zhì)對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系 Lamber定律：Al Beer定律：A C 入射光強度I0 透射光強度I 物體截面為S 厚度為l,Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律,當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，樣品對光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比 A = kcb A-吸光度 k-吸光系數(shù) c-溶液濃度 b-液層厚度,吸光度,透光度的負(fù)對數(shù) 表示物質(zhì)對光的吸收程度 A=-lgT=lg1/T=lgI0/It T-透光度 I0-入射光強度 It-透射光強度 T=It/I0,吸光系數(shù),定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時 測得的吸光度。 K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射 光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液 濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因 溶液濃度所采用的單位的不同而異。,吸光系數(shù),三種表現(xiàn)形式：摩爾吸光系數(shù) 吸光系數(shù)a 百分吸光系數(shù)E1%1cm,Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律,郎伯-比爾定律表明：當(dāng)液層厚度固定時，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。 即：A/C=const 故：只要測出某種溶液的吸光度，將它與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度進行比較，就可以算出該溶液的濃度。,討論：,1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）: 入射光為單色光 溶液是均勻，無散射溶液 2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品 3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性如果 溶液中同時存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì) ,則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性 物質(zhì)吸光度的總和，即： A（a+b+c）AaAbAc 應(yīng)用：多組分測定,偏離Beer定律的因素,依據(jù)Beer定律,A與C關(guān)系 應(yīng)為經(jīng)過原點的直線 偏離Beer定律的主要因素 表現(xiàn)為以下兩個方面：,（一）光學(xué)因素 （二）化學(xué)因素,（一）光學(xué)因素,1非單色光的影響： Beer定律應(yīng)用的重前提入射光為單色光,照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后 并非真正單色光 其波長寬度由入射狹縫的寬度 和棱鏡或光柵的分辨率決定 為了保證透過光對檢測器的響 應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度 這就使分離出來的光具一定的 譜帶寬度,討論,入射光的譜帶寬度嚴(yán)重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀 E1E2 A=E1CL E1E2 A與C不成線性關(guān)系，偏離Beer定律 （E2-E1) A與C偏離線性關(guān)系越嚴(yán)重 結(jié)論： 選擇較純單色光（，單色性） 選max作為測定波長,（一）光學(xué)因素,2. 雜散光的影響 雜散光是指從單色器分出的光不在入射 光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠。 雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件 污染造成 雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值。,（一）光學(xué)因素,3反射光和散色光的影響： 反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi) 的光直接對T產(chǎn)生影響。 散射和反射使T，A，吸收光譜變形 注：一般可用空白對比校正消除 4非平行光的影響： 使光程，A，吸收光譜變形,（二）化學(xué)因素,溶液中的溶質(zhì)可因 c 的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離 L-B 定律的現(xiàn)象 。 例：在水溶液中，Cr()的兩種離子存在 如下平衡 Cr2O42- + H2O 2CrO42- + 2H+,定量分析方法,(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液對比法（外標(biāo)一點法） (3) 吸光系數(shù)法,標(biāo)準(zhǔn)曲線法最經(jīng)典方法,前提：固定儀器和固定條件 過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列 分別測定 A 得CA曲線 樣品 測定A樣 查得C樣,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,標(biāo)準(zhǔn)溶液對比法,在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶 液和濃度為cx的試樣溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax ，依據(jù)朗伯-比爾定律得: As=Kbcs Ax=Kbcx 則: cx = cs*Ax /As,標(biāo)準(zhǔn)溶液對比法,吸光系數(shù)法,吸光系數(shù)法又稱絕對法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達式AKbc進行計算的定量分析方法。在手冊中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長 處的吸光系數(shù) 或 ,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為： 或,內(nèi)容,一 概述 二 基本原理 終點法 三 檢測方法 固定時間法 連續(xù)監(jiān)測法,終點法,終點法通過檢測終點吸光度的改變大小來求出被測物含量。 何為終點？如何判斷？ 通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)選擇兩個吸光度值，求其平均值，根據(jù)兩點的差值來判斷反應(yīng)終點。,終點法,終點時間的確認(rèn)： 一、根據(jù)時間-吸光度曲線 如:Trinder反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘 時其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點。 二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合干擾物的反應(yīng) 情況來確定 如:溴甲酚綠法測血清白蛋白,分類,終點法： 一點終點法 二點終點法 免疫比濁法 雙波長法,一點終點法,一點終點法在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時，選擇一個時間點測定吸光度值。 通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)讀兩個吸光度，求出兩點的平均值，并根據(jù)兩點的差值判斷反應(yīng)是否達到平衡。,一點終點法的設(shè)置：,以R和S混合之前的空氣空白、水空 白或試劑空白的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)達到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點且成直線，對于反應(yīng)速度快的多用。 如：GLU TG CH等,2019/5/17,37,Al,T （時間）,A,S+R,(吸光度）,一點終點法反應(yīng)曲線,計算公式： C=(Am-Ab)*K Am-終點讀數(shù)點的吸光度 Ab-試劑空白吸光度 K-校正系數(shù),二點終點法,第二試劑加入以前，選擇某一點讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時間后反應(yīng)達終點后測 第二個吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計 算結(jié)果。 第一點吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。,2019/5/17,40,An,T,A,R2,Am,S+R1,(吸光度）,（時間）,兩點終點,Ax=,樣本空白,An - k0 Am,（體積校正因子）k0,=,Sv+Rl Sv+R1+R2,兩點終點法,計算公式： C=(An-K0*Am)*K K0-體積校正因子 K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2),免疫比濁法,通過物質(zhì)對光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的 方法： 散射比濁：特定蛋白分析儀 透射比濁：自動生化分析儀 通常作兩點終點法分析，多采用多點校準(zhǔn)。 應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、 C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab 過量，此時Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加 而遞增，光散/透射射強度與抗原量成正比。,免疫比濁法,優(yōu)點： 方法簡便 結(jié)果準(zhǔn)確 可用于自動化儀器檢測 缺點：抗體用量大 達平衡時間長,雙波長法,消除樣品中對測定有干擾的物質(zhì)的影響； 在試樣中含有兩個組分a和b時，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸 收波長1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長2 ，使組分a在這兩個波長處的吸光度相等。,雙波長法,試樣溶液在2和1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān),干擾物質(zhì),1.脂血：吸收光譜300600nm呈下降趨勢 2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm 吸收峰 3.膽紅素：300500nm有吸收峰 可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長 有重疊現(xiàn)象。,雙波長法,主波長的選擇 反應(yīng)體系中待測組分吸收峰對應(yīng)的波長，盡量避開或減少來自試劑空白和樣本空白對測定組分的干擾，提高特異性和靈敏度。,雙波長法,輔助波長的選擇： 根據(jù)測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測定波長同輔助波長有相同的吸光度，待測物吸光度差異很大。 如:鉬酸銨法測P3用340nm，而Hb在340 及380nm均有較高吸收峰，選380nm作為輔助波長。,雙波長法,雙波長測定優(yōu)點 ： 消除噪音干擾 減少雜散光影響 減少樣品本身光吸收的干擾,固定時間法,指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，這兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，利用這兩點吸光度差值計算結(jié)果。 如：苦味酸法測肌酐,固定時間法,計算公式： C=(A2-A1)*K,A1,A2,T,(吸光度）,連續(xù)監(jiān)測法,根據(jù)反應(yīng)速度與待測物的濃度成正比，通過測定一段時間內(nèi)吸光度的變化速率（ A/min ）來計算待測物的濃度。 酶活性測定常用,酶促反應(yīng)曲線,連續(xù)監(jiān)測法,零級反應(yīng)期-酶促反應(yīng)速度達到并保持恒定速率進行反應(yīng)，單位時間內(nèi)的變化速率恒定不變。 在零級反應(yīng)期單位時間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率A/min)與酶活力呈正比。,連續(xù)監(jiān)測法,測定時間的選擇： 監(jiān)測時間應(yīng)根據(jù)所用儀器不影響檢測速度和結(jié)果的準(zhǔn)確性選在時間反應(yīng)進程曲線的線性期。通常： 延遲時間：30-60秒 監(jiān)測時間：120秒,1.連續(xù)監(jiān)測法,即零級反應(yīng)速率法,亦稱斜率法 在較長反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時間(530秒)讀取一次吸光度值，至 少讀取4點，得到3個以上A，最后算出 反應(yīng)速率A/min。,2019/5/17,58,Al,T,A,S+R1,R2,A2,(吸光度）,（時間）,速率法,A/min=(A2-A1 )-(空白)/(t2-t1),1.連續(xù)監(jiān)測法特點,與固定時間法相比，屬于即時觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進程，很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級反應(yīng)。,2.兩點速率法,主要用于其反應(yīng)過程不成線性，這樣只注意其反應(yīng)的起始點和終止點，而忽視其中間過程的線性變化。 如：測定苦味酸法測Cr，反應(yīng)過程中Vit C、丙酮酸、蛋白質(zhì)等均可與苦味酸生成紅色化合物而干擾反應(yīng)，通常選擇1min內(nèi)的兩點進行測定。,A2,T,A,S+R1,A1,R2,(吸光度）,（時間）,兩點速率法,Ax=,A2-A1,t,t,兩點速率法,缺點：人為確定t 1、t 2，不定因素較多，不能保證反應(yīng)在t 1-t 2