水稻顯性矮稈基因特征分析及功能研究

分類號 S511 學 號 博士學位論文水稻顯性矮稈基因Epi-df的圖位克隆、表觀修飾特征分析及功能研究張 立 國指導(dǎo)教師萬建民 教授專業(yè)名稱遺 傳 學研究方向水稻分子遺傳答辯日期二一二年十二月POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epi-df IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ByZhang LiguoA dissertation submitted toNanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements for Doctoral Degree SupervisedByProfessor Wan JianminDepartment of Crop Genetics and Breeding Nanjing Agricultural University Nanjing , P.R.ChinaDecember 2012原 創(chuàng) 性 聲 明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學位論文作者（需親筆）簽名： 年 月 日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學位論文。保密，在 年解密后適用本授權(quán)書。本學位論文屬于不保密。 （請在以上方框內(nèi)打“”）學位論文作者（需親筆）簽名： 年 月 日導(dǎo)師（需親筆）簽名： 年 月 日目 錄摘 要IABSTRACTIII縮略詞V第一章 文獻綜述11 水稻株高的研究概況11.1 水稻矮化突變體的遺傳研究進展11.2 水稻矮化機制的研究進展21.3 水稻顯性矮稈突變體的研究進展62 植物表觀遺傳調(diào)控的分子機制72.1 表觀遺傳學的定義和研究內(nèi)容72.2 DNA甲基化72.3 組蛋白修飾132.4 表觀遺傳學的研究方法172.5 表觀等位基因的克隆193 PcG蛋白介導(dǎo)的基因沉默與植物發(fā)育203.1 PcG蛋白復(fù)合體的組成和分類213.2 PcG蛋白與TRX蛋白的相互拮抗223.3 PcG蛋白介導(dǎo)的H3K27me3修飾的建立、維持以及識別233.4 PcG蛋白對植物發(fā)育的調(diào)控254 本研究的目的和意義27第二章 水稻Epi-df突變體的表型及遺傳分析291 材料與方法291.1 實驗材料與田間種植291.2 Epi-df降稈能力調(diào)查301.3 Epi-df花器官突變、花粉育性以及結(jié)實率調(diào)查301.4 Epi-df遺傳規(guī)律和回復(fù)突變調(diào)查302 結(jié)果與分析302.1 Epi-df表型分析302.2 Epi-df花器官變異及育性分析312.3 Epi-df降稈能力分析342.4 Epi-df遺傳規(guī)律分析343 討論373.1 Epi-df具有潛在的育種利用價值373.2 Epi-df遺傳穩(wěn)定但存在低頻率的回復(fù)突變38第三章 水稻顯性矮稈基因Epi-df的圖位克隆及轉(zhuǎn)基因驗證391 材料與方法391.1 實驗材料與田間種植391.2 DNA提取401.3 PCR分析401.4 分子標記設(shè)計411.5 基因定位411.6 候選基因預(yù)測和測序421.7 RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR421.8 轉(zhuǎn)基因互補載體的構(gòu)建421.9 轉(zhuǎn)基因過表達載體的構(gòu)建431.10 農(nóng)稈菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化431.11 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定432 結(jié)果與分析442.1 初定位和精細定位442.2 候選基因分析452.3 候選基因的測序和表達分析462.4 轉(zhuǎn)基因驗證473 討論493.1 Epi-df突變表型來自FIE1基因的異位表達493.2 FIE1異位表達可能是由表觀突變導(dǎo)致的50第四章 水稻FIE1基因的表觀遺傳修飾及功能分析511 材料與方法521.1 DNA甲基化分析521.2 亞硫酸鹽法DNA甲基化測序531.3 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）531.4 生物信息學分析531.5 胚乳RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR531.6 印記分析541.7 酵母雙雜交分析541.8 Microarray分析552 結(jié)果與分析552.1 FIE1基因DNA甲基化分析552.2 FIE1基因位點組蛋白H3K9me2和H3K4me3分析602.3 FIE1基因結(jié)構(gòu)及蛋白同源分析612.4 FIE1基因表達模式分析642.5 FIE1基因印記分析662.6 FIE1蛋白與水稻E（z）類蛋白互作682.7 FIE1基因異位表達對靶基因H3K27me3修飾的影響693 討論713.1 Epi-df是水稻中發(fā)現(xiàn)的第一個DNA去甲基化表觀突變體713.2 FIE1的胚乳特異性表達和印記模式受DNA甲基化調(diào)控723.3 FIE1蛋白參與PcG蛋白復(fù)合體PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制733.4 水稻中PRC2介導(dǎo)的H3K27me3修飾途徑受H3K9me2的調(diào)控74第五章 全文討論與結(jié)論751 討論751.1 Epi-df具有自身的表觀遺傳學特征751.2 表觀遺傳修飾對水稻兩個FIE基因的功能分化起重要作用751.3 水稻H3K27me3的正常功能依賴于H3K9me2對FIE1的轉(zhuǎn)錄抑制762 結(jié)論762.1 Epi-df是一個降稈能力較強的顯性矮稈突變體762.2 Epi-df的表型是由FIE1基因的表觀遺傳突變導(dǎo)致的762.3 FIE1的表達模式和印記特征受表觀遺傳修飾調(diào)控772.4 FIE1參與PRC2介導(dǎo)的基因沉默783 本文創(chuàng)新之處78參考文獻79附 錄97在讀期間發(fā)表的論文109致 謝111水稻顯性矮稈基因Epi-df的圖位克隆、表觀修飾特征分析及功能研究摘 要株高是與產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，株高超過一定范圍容易引起倒伏而減產(chǎn)，矮稈不僅有利于抗倒伏，而且耐貧瘠，有利于提高產(chǎn)量。20世紀50年代末開始的矮化育種，使水稻株高降低至半矮稈，水稻單產(chǎn)獲得了第一次飛躍，成為“綠色革命”的標志性成就之一。目前正在進行的超級稻育種主要利用理想株型和秈粳亞種間雜種優(yōu)勢以期水稻單產(chǎn)得到進一步提高。迄今水稻育種中利用的矮稈基因都是隱性基因，雜交水稻育種中隱性矮稈基因的使用往往要求雙親必須具有同一矮稈基因，這就限制了在更廣泛的資源中選擇有利親本。但是如果利用顯性矮稈基因，則能夠使水稻種質(zhì)資源得到更有效的利用和縮短育種時間。因此發(fā)掘新的水稻株高控制基因特別是顯性矮稈基因，對進一步提高水稻單產(chǎn)具有重要意義。本研究對顯性矮稈突變體Epi-df進行了系統(tǒng)的表型考察和降稈能力分析，并對產(chǎn)生矮化的分子機制進行了深入研究。主要研究結(jié)果如下：（1）Epi-df從苗期至成熟期表現(xiàn)矮化，并且與野生型雜交F1表現(xiàn)類似突變體的表型，因此，Epi-df屬于顯性矮稈突變體。Epi-df與秈稻品種培矮64正反交F1株高介于兩者之間，F(xiàn)2代分離群體中高株和矮株數(shù)比例接近1：3，表明Epi-df表型是由單顯性核基因控制。將Epi-df與3個秈稻品種和3個粳稻品種雜交，降稈率介于16.3%至50.4%之間，表明Epi-df具有較強的降稈能力，有望在水稻秈粳交雜種優(yōu)勢利用育種中得到應(yīng)用。（2）利用圖位克隆方法將突變基因精細定位在49kb區(qū)域內(nèi)，但并未發(fā)現(xiàn)DNA序列突變，卻發(fā)現(xiàn)其中的ORF5在突變體中表達強烈，而在野生型中沉默。Epi-df還存在另外一個特征，即雖然表現(xiàn)遺傳穩(wěn)定但存在低水平的回復(fù)突變頻率，因此ORF5的異位表達可能是由表觀遺傳變異引起的。DNA甲基化測序結(jié)果表明FIE15端發(fā)生了DNA去甲基化，這與FIE1的異位表達是一致的。盡管FIE1在回復(fù)突變株中保持沉默，但DNA甲基化并未恢復(fù)到野生型水平，發(fā)生恢復(fù)的位點主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點附近和第3個外顯子。另外，Epi-df中FIE15端H3K9me2水平下降，而H3K4me3水平上升，這與FIE1基因的異位表達和DNA去甲基化是一致的。因此，Epi-df是一個表觀遺傳突變體，這為研究表觀遺傳修飾對單子葉植物尤其是重要作物的生長發(fā)育的調(diào)控提供了重要材料。（3）FIE1是胚乳特異性表達的基因，并且具有僅母本表達的印記特征。FIE1在葉片、莖和幼穗中存在高水平的DNA甲基化，而在受精后第6、9和12天的胚乳中甲基化水平嚴重降低，并且F1胚乳中母本FIE1的DNA甲基化水平比父本低很多，因此FIE1的表達模式和印記特征受DNA甲基化調(diào)控。與擬南芥僅有一個FIE基因不同，水稻含有兩個FIE基因，另一個FIE基因FIE2是組成性表達的，因此我們推測水稻基因組復(fù)制以及隨后的進化過程中，表觀遺傳修飾對兩個FIE基因的功能分化起了重要作用。（4）酵母雙雜交結(jié)果表明FIE1與iEZ1以及CLF互作，表明FIE1參與水稻中PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)Epi-df中有305個基因的表達發(fā)生了改變，其中222個基因下調(diào)，83個基因上調(diào)。利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些表達量改變的基因同時伴隨著H3K27me3修飾的改變。因此，F(xiàn)IE1的異位表達導(dǎo)致靶基因H3K27me3修飾水平和表達量的改變，從而使Epi-df表現(xiàn)突變表型。（5）H3K9me2和H3K27me3是與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)非常保守的兩種表觀遺傳修飾， H3K9me2主要集中在異染色質(zhì)，起抑制轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座的功能；H3K27me3基本存在于常染色質(zhì)，起抑制基因轉(zhuǎn)錄和維持細胞記憶的功能。染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明FIE15端存在高水平的H3K9me2，而Epi-df中H3K9me2水平降低引起FIE1異位表達和基因組水平上H3K27me3分布異常，從而導(dǎo)致水稻發(fā)育缺陷。因此，H3K9me2控制的FIE1轉(zhuǎn)錄抑制對水稻中H3K27me3的正常功能是必需的。關(guān)鍵詞：水稻；顯性矮化；FIE1；表觀遺傳突變；H3K9me2；H3K27me3POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epi-df IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ABSTRACTPlant height is an agronomically important trait for grain yield，the higher plant is easy to be lodging and decreasing yield, whereas dwarf plant has a great harvest index because of improved lodging resistance and increasing use of nitrogen fertilizers. Dwarfism breeding resulted in the first qualitative leap for yield increase, which was well known as “green revolution”. The objective of super rice breeding is to make a breakthrough in rice yield by using ideotype and inter-subspecific heterosis. Whereas all the dwarf genes used in rice breeding is recessive by now, thus both the male and female parents must carry the same recessive dwarf gene in hybrid rice breeding process. But when one parent carries a dominant dwarf allele, the germplasm of the other parent would not be restricted. Therefore, isolation new genes that control plant height especially the dominant dwarf genes is crucial for improving rice yield. In this study, we systematacially characterized a dominant dwarf mutant Epi-df and analyzed the molecular mechanism for dwarfism.The main results as follows:(1) From seedling to mature stage, Epi-df showes dwarf phenotype. When crossed with WT, the F1 plants show the phenotype similar to Epi-df, thus, Epi-df is a dominant dwarf mutant. When crossed with PA64, the plant height of F1 is between two parents, and the ratio of normal to dwarf plants in F2 population is nearly to 1:3, suggesting that the mutant phenotype is controlled by one dominant nuclear gene. When Epi-df was crossed with three indica varieties and three japonica varieties respectively, the plant height reduction is from16.3 to 50.4%, suggesting the strong plant height reduction ability. Thus, Epi-df may be used for rice inter-subspecific heterosis breeding in the future.(2) The mutative gene was fine mapped within a 49kb region, whereas there was no nucleotide mutation. However, we found ORF5 (one of the seven ORFs within the mapping region) was ectopically expressed in Epi-df, but silenced in WT. Considered the revertants emerged from Epi-df population, we speculated that Epi-df was an epigenetic mutant. By using bisulfite sequencing, we found DNA hypo-methylation was occurred at 5 region of FIE1. We also analyzed the methylation patterns of six revertants and found even FIE1 was silenced in them, DNA methylation was not recovered to the WT level, the recovered sits were enriched around the transcriptional starting site and within the third exon. We also found there were reduced H3K9me2 and increased H3K4me3 at the 5 region of FIE1. Thus, Epi-df is an unexpected epigenetic mutant, which would like to provide an intriguing opportunity to unravel epigenetic modifications for development regulation in important crop plants.(3) We discovered that FIE1 was a maternal-specific expressing gene in endosperm, which was coincided with the methylation pattern of FIE1 in tissues. The methylation level is higher in leaf, culm and young panicle than that in endosperm 6, 9 and 12 days after pollination. We also found the methylation of maternal FIE1 was much lower than that of paternal. If Epi-df was used as pollen donator, the imprinting pattern was disturbed, and the methylation levels of both parental were lower. Unlike Arabidopsis, which contains only one ubiquitously expressed FIE gene, there are two FIE gene in rice, the other gene FIE2 is expressed in all the tissues. We conclude that during the genome duplication and the latter evolution, epigenetic marks may play an important role in the differentiation of the two FIE gene in rice.(4) Yeast two-hybrid assay showed FIE1 interacted with rice E(z) homologs, suggesting FIE1 participates in PRC2 repression which catalyzes H3K27me3 at targets. Microarray analysis showed 305 genes were misregulated in Epi-df accompanied with changed H3K27me3 levels. Thus, ectopic expression of FIE1 resulted in the mutant phenotype via abnormal distribution of H3K27me3. (5) H3K9me2 and H3K27me3 are two conserved repressive epigenetic marks in both animal and higher plants. H3K9me2 is mainly enriched in heterochromatin and functions in suppressing transposons, while H3K27me3 is mainly localized in euchromatin and provides a cellular memory to maintain the repressive state of target genes. We found there was high level of H3K9me2 at 5 region of FIE1, whereas in Epi-df, H3K9me2 was reduced and resulted in ectopic expression of FIE1 and abnormal distribution of H3K27me3. We conclude that silencing of FIE1 via H3K9me2 is essential for normal function of H3K27me3 in rice. KEY WORDS: Rice; Dominant dwarf; FIE1; Epigenetic mutation; H3K9me2; H3K4me3縮 略 詞Abbreviations英文縮寫English abbreviations英文名稱English name中文名稱Chinese nameBERBase excision repair堿基切除修復(fù)機制ChIPChromatin Immunoprecipitation染色質(zhì)免疫共沉淀DMRsDNA demethylation regionsDNA去甲基化區(qū)域DSBsDouble-strand breaks雙鏈缺口FIEFertilization independent endosperm 不依賴受精的胚乳HATsHistone acetyltransferases組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HDACsHistone deacetylases組蛋白去乙?；窰KMTsProtein lysine methyltransferases組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶H2Aub1H2A monoubiquitionation組蛋白H2A單泛素化H3K4me3Histone3 lysine4 tri-methylaiton組蛋白H3賴氨酸4三甲基化H3K9me2Histone3 lysine9 di-methylaiton組蛋白H3賴氨酸9二甲基化H3K27me3Histone3 lysine27 tri-methylaiton組蛋白H3賴氨酸27三甲基化MSAPMethylation-sensitice amplified polymorphism甲基化敏感擴增多態(tài)性PcGPolycomb group聚梳類（蛋白）PRC2Polycomb Repressive Complex 2PcG抑制復(fù)合體2PREsPolycomb response elementsPRC2反應(yīng)元件PRMTsProtein arginine methyltransferases精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶RdDMRNA-directed DNA methylationRNA介導(dǎo)的DNA甲基化TGSTranscriptional gene silencing轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默UBPsUbiquitin proteases泛素蛋白酶第一章 文獻綜述隨著人口數(shù)量的日益增加和可利用耕地面積的不斷減少，提高糧食單產(chǎn)，已成為確保我國糧食安全的最重要途徑。水稻是我國最重要的糧食作物之一，在保障我國糧食安全中始終擔當著重要角色。建國以來我國的水稻單產(chǎn)經(jīng)歷了兩次質(zhì)的飛躍，第一次是20世紀50年代末60世紀初以半矮稈基因sd-1的利用為標志的“綠色革命”，使高稈水稻品種變?yōu)榭沟狗陌氚捚贩N，水稻單產(chǎn)提高了20-30%(Peng等，1999)；第二次是70年代三系配套的成功使水稻雜種優(yōu)勢得以有效利用，水稻單產(chǎn)又在矮稈品種的產(chǎn)量基礎(chǔ)上提高了20%（程式華，2000）。矮稈資源的合理利用是水稻株型改良的基礎(chǔ),是兩次單產(chǎn)突破的關(guān)鍵。然而進入80年代末和90年代初，我國水稻單產(chǎn)進入徘徊狀態(tài)，如何進一步提高雜交水稻的單產(chǎn)是目前最為緊迫的任務(wù)。水稻秈粳亞種間F1代表現(xiàn)強大的雜種優(yōu)勢，是進一步提高水稻單產(chǎn)的有效途徑。然而秈粳亞種間雜種表現(xiàn)株高偏高，生育期超親晚熟以及結(jié)實率偏低限制了秈粳雜種優(yōu)勢的利用(楊守仁等,1982)。因此，發(fā)掘能有效降稈并抑制F1株高超親優(yōu)勢，且對其它重要農(nóng)藝性狀影響較小的顯性矮稈基因，對水稻秈粳雜種優(yōu)勢利用和進一步提高產(chǎn)量具有重要意義。表觀遺傳調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要組成部分，已成為當前研究的熱點。經(jīng)典遺傳學指出,基因結(jié)構(gòu)的改變會引起生物體表現(xiàn)型的改變,這種改變可以從上一代傳遞到下一代。然而生物體從祖先基因組中所獲得的并不僅僅是基因序列。在基因序列不發(fā)生變化的條件下，基因表達發(fā)生的改變也可以是遺傳的，導(dǎo)致可遺傳的表現(xiàn)型變異。這種可遺傳的表現(xiàn)型變化沒有直接涉及到基因序列的改變，因而是表觀的，稱之為表觀遺傳變異(Holliday, 1987; Wu等, 2001; Holliday, 2006)。研究表觀遺傳變異的遺傳學稱之為表觀遺傳學。水稻作為重要的糧食作物和模式植物，許多生物過程受表觀遺傳調(diào)控，因此在水稻中開展表觀遺傳學研究具有重要的理論和現(xiàn)實意義。1 水稻株高的研究概況1.1 水稻矮化突變體的遺傳研究進展傳統(tǒng)水稻品種一般為高稈，矮化是水稻的突變性狀。高稈品種易倒伏，利用價值不高，矮稈水稻品種因具有較高的利用價值而研究較多。根據(jù)株高矮化的程度，廣義的矮稈又分為半矮稈、矮稈和極矮稈3種類型。狹義的矮稈通常指成熟時株高等于或低于原正常株高一半的類型；半矮稈是指株高介于矮稈和正常株高之間的矮稈類型。水稻植株矮化是由節(jié)間縮短或節(jié)間數(shù)目減少導(dǎo)致的，也有可能是兩者共同作用的結(jié)果。Takedea(1977)以節(jié)間長度占株高的比例為指數(shù)將矮稈分為dn、dm、dg、nl和sh五種類型，將節(jié)間比例正常的品種定為N型。dn類型的特征是各節(jié)間比例與N型類似；dg類型的特點是第二節(jié)間縮短；nl類型的特征是有莖葉，第一節(jié)間縮短而第四節(jié)間伸長，偶爾有第六節(jié)間伸長；dm類型的特征是第二節(jié)間特別短；sh類型的特征是第一節(jié)幾乎不伸長，穗部包在劍葉葉鞘中。除dn類型外，其余類型都存在某一特定節(jié)間的縮短，這表明不同矮化基因作用于不同的節(jié)間伸長。水稻矮稈遺傳主要有兩種類型：一類是由單基因控制的質(zhì)量性狀遺傳，另一類是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。生產(chǎn)上利用的秈稻主要矮源大部分是隱性單基因遺傳，并且與sd-1等位。與秈稻相比，粳稻的矮化遺傳要復(fù)雜的多，根據(jù)控制矮化的基因?qū)?shù)分為兩類：一類是受單個矮稈主效基因控制，并且這些主效基因大多不等位；另一類是受多個微效矮稈基因控制。Parnell等（1922）報道了1個由隱性單基因控制的自然矮稈突變體,這是有關(guān)水稻矮生性遺傳的最早報道。自上世紀六十年代以來,伴隨著水稻矮化育種的發(fā)展,新發(fā)現(xiàn)的水稻矮稈基因不斷增加。盧永根等（1979）和顧銘洪等（1988）對我國秈稻品種的矮生性遺傳作了系統(tǒng)性研究，發(fā)現(xiàn)我國秈稻中存在的矮稈基因有四個：sd-1、sd-g、sd-n(t)和sd-t(t)。目前我國生產(chǎn)上秈稻利用的矮源主要來自矮腳南特、矮仔占、低腳烏尖、花龍水田谷和矮種水田谷,它們均受1對隱性基因sd-1控制。Monna等（2002）利用圖位克隆分離出sd-1基因，發(fā)現(xiàn)它編碼赤霉素合成途徑的一個關(guān)鍵酶：赤霉素20-氧化酶。梁國華等（2004）利用新桂矮雙矮和02428雜交產(chǎn)生的F2代分離群體，將sd-g精細定為于第5染色體約85kb的區(qū)域內(nèi)。李欣等（2001，2002）通過遺傳分析發(fā)現(xiàn)sd-t（t）和sd-n（t）分別位于第4、5染色體。江光懷（2002）利用矮泰引2號和無葉舌標記基因系B30為材料,將sd-t(t)基因定位在水稻第4染色體約147kb的范圍內(nèi)。1.2 水稻矮化機制的研究進展1.2.1 水稻矮化與植物內(nèi)源激素的關(guān)系矮稈基因能直接導(dǎo)致水稻植株形態(tài)學變化，如細胞長度變短和細胞數(shù)目減少，從而引起植株節(jié)間變短和植株變矮。目前克隆的水稻矮稈基因大多涉及到激素代謝和信號傳導(dǎo)，表明植物內(nèi)源激素對水稻株高具有重要的調(diào)節(jié)作用。植物激素都是簡單的小分子有機化合物，但它們的生理效應(yīng)卻非常復(fù)雜，可以影響植物細胞的分裂、伸長以及分化，從而影響植物株高以及其它生理過程。隨著氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)和同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用, 對植物內(nèi)源激素的種類、結(jié)構(gòu)、合成途徑和信號傳導(dǎo)等獲得了較深入的了解。近年來植物分子遺傳學的發(fā)展,使植物激素對植物生理影響的研究逐步深入到分子水平。根據(jù)植物矮化突變體對外源激素的反應(yīng),可將其分為缺陷型和不敏感型兩類。缺陷型矮化突變體的活性激素生物合成途徑被抑制或阻斷，使得植物內(nèi)源活性激素缺乏或痕量存在，體外施用相應(yīng)的活性激素后可使突變體的矮化表型得以恢復(fù)；激素不敏感型矮化突變體的內(nèi)源活性激素水平變化不大，甚至比野生型的還高,這類突變體在體外施用相應(yīng)的活性激素后不能恢復(fù)野生型表型，這可能是在激素信號傳導(dǎo)過程中出現(xiàn)障礙。目前有關(guān)植物激素對株高影響研究最多的是赤霉素（GA）和油菜素內(nèi)酯（BR）這兩大類激素，對它們合成代謝的研究已經(jīng)較為成熟，而信號傳導(dǎo)的研究還并不完善。1.2.2 水稻矮稈基因的克隆及功能研究迄今為止已獲得了超過70個水稻矮化突變體，并且許多矮化基因已被定位或克隆。在這些已被克隆的基因中，大多涉及到赤霉素或油菜素內(nèi)酯的代謝或信號傳導(dǎo)，表明這兩類植物內(nèi)源激素在水稻株高調(diào)控中起主導(dǎo)作用。赤霉素是廣泛存在的一大類植物激素的總稱，其化學結(jié)構(gòu)都屬于二萜類酸，由四環(huán)骨架衍生而來。它能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的許多過程，例如種子萌發(fā)、節(jié)間伸長、葉片伸展、開花以及果實發(fā)育等(Olszewski等, 2002)。上個世紀60年代在水稻和小麥中進行的利用與赤霉素相關(guān)半矮稈突變體進行的矮化育種大幅提高了糧食產(chǎn)量，被稱為“綠色革命”(Peng等, 1999)。在“綠色革命”中廣泛應(yīng)用的水稻半矮稈基因sd-1就是GA-20氧化酶（GA20ox2）編碼基因。在sd-1突變體中，赤霉素合成的前體物質(zhì)GA53顯著增加，而有活性的GA20和GA1減少 (Monna等, 2002; Sasaki等, 2002; Spielmeyer等, 2002)。水稻基因組中存在兩個GA20ox基因：GA20ox1和GA20ox2。GA20ox2對應(yīng)于sd-1位點，它在葉片、節(jié)間和已開放的花中表達強烈，而GA20ox1主要在未開放的花中表達。研究表明GA20ox1與sd-1的表型無關(guān)，但它在未開放的花中表達，因此在GA20ox2突變的情況下可以維持赤霉素在花中的濃度，使水稻的育性不受影響。eui(elongated uppermost internode)突變體在水稻雜交制種過程中得到廣泛利用，它能使不育系的第一節(jié)間伸長從而使穗部從劍葉葉鞘中伸出，從而接受恢復(fù)系的花粉。EUI編碼一種細胞色素P450，主要在節(jié)間分裂旺盛的區(qū)域表達，它能使有活性的GA4通過16a，17-脫羥基反應(yīng)而失活。EUI突變后有活性的GA4和GA1水平升高，使最上節(jié)間細胞分裂旺盛從而伸長(Zhu等, 2006)。上世紀50年代日本育種人員利用半矮稈品種Tan-Ginbozu育成的水稻新品種大幅提高了產(chǎn)量。Tan-Ginbozu含有d35基因，并且研究認為d35可能參與赤霉素合成的前期階段。Itoh等（2004）克隆了D35基因，發(fā)現(xiàn)它編碼貝克衫烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO），并且與擬南芥和南瓜的貝克杉烯氧化酶高度同源。Sakamoto等（2004）利用其它物種中已知的赤霉素合成酶基因，從水稻基因組數(shù)據(jù)庫中分離了水稻赤霉素合成途徑中的29個候選同源基因。通過比較發(fā)現(xiàn)與擬南芥中單個的赤霉素合成酶基因不同，水稻中的柯巴基焦磷酸合成酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）基因，貝殼杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）基因以及貝殼杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）基因分別存在多個同源基因，并且這些同源基因都分布在連續(xù)的某個區(qū)域。作者還鑒定了18個赤霉素合成缺陷型突變體并發(fā)現(xiàn)分別屬于6個不同的等位基因。通過研究發(fā)現(xiàn)赤霉素合成途徑前期所需的催化酶如CPS、KS、KO以及KAO是由單基因編碼的，而后期所需酶類如GA20ox、GA3ox和GA2ox是由多基因編碼的。剩余的CPS、KS以及KO類似蛋白則可能與赤霉素合成無關(guān)，可能涉及到抗逆相關(guān)的二萜類植物抗毒素的合成。水稻中最早發(fā)現(xiàn)的赤霉素不敏感突變體是dwarf1，表現(xiàn)矮化、葉寬且深綠、花序緊湊和小粒等表型。圖位克隆后發(fā)現(xiàn)DWARF1編碼GTP結(jié)合蛋白a亞基(Ashikari等, 1999)。由于dwarf1表現(xiàn)對赤霉素不敏感，推測GTP結(jié)合蛋白可能在赤霉素信號傳導(dǎo)過程中起作用(Ueguchi-Tanaka等, 2000)。擬南芥中的GAI(Gibberllin-insensitive)是赤霉素響應(yīng)的負調(diào)控因子，突變后使擬南芥矮化(Peng等, 1997)。小麥和玉米中的GAI同源基因分別是Rht和D8，在上世紀60年代進行的矮化育種中對提高產(chǎn)量起了重要作用，與sd-1同時被稱為“綠色革命基因”(Peng等, 1999)。水稻中的GAI同源基因是SLR1，slr1(slender rice1)突變體植株苗期細長,并且對赤霉素反應(yīng)不敏感。SLR1編碼DELLA結(jié)構(gòu)域蛋白，DELLA結(jié)構(gòu)域在赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中對赤霉素的響應(yīng)非常重要(Ikeda等, 2001)。對不敏感突變體gid2(gibberellin insensitive dwarf2)的分析表明GID2編碼一個SCF E3泛素連接酶復(fù)合體中的F-box亞基。GID2是赤霉素響應(yīng)的正調(diào)控因子，它能在赤霉素存在的情況下結(jié)合SLR1，從而引導(dǎo)其通過SCFGID2蛋白酶體途徑降解(Gomi等, 2004)。對另外一個赤霉素不敏感突變體gid1(gibberellin insensitive dwarf1)分析發(fā)現(xiàn)，GID1能夠結(jié)合有生物活性的赤霉素，并且這種結(jié)合能夠促進GID1和SLR1的結(jié)合，從而激活SCFGID2蛋白酶體途徑降解SLR1。這些結(jié)果表明GID1可能是赤霉素受體(Ueguchi-Tanaka等, 2005; Hartweck等, 2006)。除此之外，赤霉素信號傳導(dǎo)途徑的其它組分和DELLA蛋白的其它功能還未知。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid, BR）是植物中最早發(fā)現(xiàn)的一類甾醇類植物內(nèi)源生長促進激素，20世紀70年代從油菜的花粉中首次分離到(Mitchell等, 1970)。BR在植物組織中含量很低，但對生長發(fā)育起重要作用。現(xiàn)已證明BR在植物的種子休眠與萌發(fā)、器官分化、維管組織發(fā)育、開花和衰老以及向性建成等過程中起重要調(diào)控作用(Yamamoto等, 1997; Bishop等, 2001; Yamamoto等, 2001)。brd1(brassinosteriod-deficient dwarf1)是水稻中發(fā)現(xiàn)的第一個BR缺陷型突變體，它最顯著的特征是節(jié)間伸長嚴重受阻、葉鞘縮短、葉片短而卷曲、分蘗減少以及不育。施加外源BR后能恢復(fù)表型，因此推斷brd1突變體中BR合成受阻。BRD1編碼一個BR C-6氧化酶（OsBR6ox），突變后導(dǎo)致有生物活性的BR如油菜素甾酮（Castasterone）、香蒲甾醇（Typhasterol）以及茶甾酮（Teasterone）減少，從而導(dǎo)致矮化等表型(Hong等, 2002)。d2(dwarf2)是發(fā)現(xiàn)的另外一種BR缺陷型突變體，株高為野生型的70-80%，第二節(jié)間縮短，葉傾角變小。施加外源BR后突變表型得到恢復(fù)。D2編碼細胞色素P450家族的一個新成員CYP90D2，催化從6-脫氧茶甾酮（6-deoxoteasterone）到3-脫氫-6-脫氧茶甾酮（3-dehydro-6-deoxoteasterone）和茶甾酮（teasterone）到3-脫氫茶甾酮（3-dehydroteasterone）的反應(yīng)，在BR合成途徑的后期起作用(Hong等, 2003)。d11(dwarf11)表現(xiàn)出矮化和種子變短突變表型，施加外源BR能恢復(fù)野生型表型，證明D11在BR合成途徑中起作用。D11編碼一個新的細胞色素P450（CYP724B1），推測可能在6-脫氧香蒲甾醇(6-deoxo-Typhasterol)和香蒲甾醇(Typhasterol)合成中起作用(Tanabe等, 2005)。brd2(BR-deficient dwarf2)突變體在營養(yǎng)生長前期并未表現(xiàn)出明顯表型，而在生長后期表現(xiàn)出明顯BR缺陷表型，抽穗后株高僅相當于野生型的40%。BRD2編碼擬南芥的同源蛋白DIM/DWF1，催化從24-亞甲基膽固醇（24-methylenecholesterol）到油菜甾醇（campesterol）這一過程(Hong等, 2005)。OsDWARF4與D11存在功能冗余，共同作用于C-22羥基化反應(yīng)。Tos17插入突變體osdwarf4僅表現(xiàn)出葉傾角變小和葉片上舉表型，而葉片、花以及粒型都正常，在BR合成方面僅有輕微影響。Tanaka等（2006）發(fā)現(xiàn)在密植但不施加更多肥料的情況下，osdwarf4能提高產(chǎn)量(Sakamoto等, 2006)。Sakamoto等（2006）利用同源克隆的方法發(fā)現(xiàn)水稻中存在兩個擬南芥CYP90A1/CPD的同源基因：CYP90A3/OsCPD1和CYP90A4/OsCPD2，它們催化BR合成中的C-23a羥基化反應(yīng)。Tos17插入突變體oscpd1-1并未表現(xiàn)出BR缺陷型表型，作者推測它們之間存在功能冗余。BR信號傳導(dǎo)相關(guān)突變體同樣表現(xiàn)出BR缺陷型類似的表型，但施加外源BR不能使表型恢復(fù)。水稻中發(fā)現(xiàn)的第一個BR不敏感型突變體是d61,它對BR的反應(yīng)沒有野生型敏感。圖位克隆后發(fā)現(xiàn)D61與擬南芥BRI1同源，編碼BR受體激酶OsBRI1(Brassinosteriod insensitive1)(Yamamuro等, 2000)。Bai等（2007）依據(jù)序列比對發(fā)現(xiàn)擬南芥BZR1(Brassinazole resistant1)在水稻中含有4個同源蛋白，其中OsBZR1與BZR1同源性最高。OsBZR1的RNAi植株表現(xiàn)出矮化、直立葉、BR敏感性降低和BR響應(yīng)基因表達等表型，表明OsBZR1在水稻BR信號傳導(dǎo)中起重要作用。酵母雙雜交結(jié)果表明14-3-3蛋白與OsBZR1互作。OsBZR1蛋白序列中與14-3-3蛋白互作的位點突變后，導(dǎo)致OsBZR1體內(nèi)或體外都無法與14-3-3蛋白互作，并且這種突變后的OsBZR1在擬南芥中表達后能抑制bri1-5的突變表型，表明14-3-3蛋白與OsBZR1互作能阻止OsBZR1進入核內(nèi)，從而抑制OsBZR1的功能(Bai等, 2007)。Tanaka等（2009）發(fā)現(xiàn)過表達BU1(BRASSINOSTEROID UPREGULATED1)基因能使水稻葉傾角變大、籽粒變大和增加對BR抑制劑油菜素唑（Brassinazole，Brz）的抗性。BU1的干擾植株則表現(xiàn)出葉傾角變小。在BU1過表達植株中有活性的油菜素甾酮及前體物質(zhì)并沒有增加，表明BU1是作為BR信號通路的正調(diào)控因子起作用的。Tong等（2009）發(fā)現(xiàn)一個矮化少蘗突變體dlt(dwarf and low tillering)，DLT編碼一個植物特有的GRAS家族蛋白，并且OsBZR1蛋白能結(jié)合到DLT的啟動子，這與DLT對BR處理的負反饋調(diào)控機制相一致。張等（2009）在水稻T-DNA插入突變體中發(fā)現(xiàn)一個葉傾角增大突變體ili1-D(increased lamina joint inclination)，該表型與過量施加BR后的表型類似。突變表型是由于T-DNA插入位點附近的一個HLH蛋白編碼基因過表達造成的。ILI1能夠與一個堿性螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白IBH1互作，過表達IBH1能導(dǎo)致水稻葉傾角增大,而過表達ILI1能抑制過表達IBH1引起的矮化。因此，ILI1能夠通過與IBH1形成異源二聚體從而抑制IBH1的功能。1.3 水稻顯性矮稈突變體的研究進展雜種優(yōu)勢的利用是增加水稻生物學產(chǎn)量的有效途徑之一,特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用可以大幅度提高產(chǎn)量(袁隆平, 2008)。然而F1代株高超親成為亞種間雜種優(yōu)勢利用的一個瓶頸。在雜交水稻育種過程中，為了防止F1株高過高，兩個親本必須同時含有同一個隱性矮稈基因，從而排除了在數(shù)量更大、遺傳基礎(chǔ)更為多樣的中、高稈水稻品種里尋找雜交稻親本的可能性。而顯性矮稈基因的利用可以解決這個問題,同時在一定