GB 5009.240-2016 食品安全國家標準 食品中伏馬毒素的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 食品安全國家標準 食品中伏馬毒素的測定 2 0 1 6 - 0 8 - 3 1發(fā)布2 0 1 6 - 0 9 - 2 0實施 中華人民共和國 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 發(fā) 布 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 前 言 本標準代替G B/T2 5 2 2 82 0 1 0 糧油檢驗 玉米及其制品中伏馬毒素含量測定 免疫親和柱凈 化高效液相色譜法和熒光光度法 、 S N/T1 9 5 82 0 0 7 進出口食品中伏馬毒素B1殘留量檢測方法 酶 聯(lián)免疫吸附法 、 S N/T1 5 7 22 0 0 5 進出口糧谷中伏馬毒素檢驗方法 高效液相色譜法 。 本標準將以上標準進行了整合, 主要修訂如下: 標準名稱修改為“ 食品安全國家標準 食品中伏馬毒素的測定” ; 伏馬毒素種類增加為伏馬毒素B 1、B2、B3三種; 增加了免疫親和柱凈化-柱后衍生液相色譜法作為第一法; 增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為第二法; 取消熒光光度法; 改變了樣品提取溶液; 改變了免疫親和柱凈化-柱前衍生高效液相色譜法流動相的組成。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 1 食品安全國家標準 食品中伏馬毒素的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了玉米及其制品中伏馬毒素B 1、 伏馬毒素B2、 伏馬毒素B3( 以下簡寫為F B1、F B2、F B3) 的測定方法。 本標準第一法為柱后衍生液相色譜法, 第二法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法, 第三法為柱前衍生液 相色譜法, 適用于玉米及其制品中伏馬毒素的測定。 第一法 免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法 2 原理 樣品用乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過免疫親和柱凈化, 去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干 擾物質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜分離后柱后鄰苯二甲醛衍生, 熒光檢測, 外標法定量。 3 試劑和材料 除非另有說明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。 3.1 試劑 3.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。 3.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。 3.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。 3.1.4 氫氧化鈉(N a OH) 。 3.1.5 氯化鈉(N a C l) 。 3.1.6 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。 3.1.7 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。 3.1.8 氯化鉀(K C l) 。 3.1.9 硼砂(N a2B4O71 0 H2O) 。 3.1.1 0 2 -巰基乙醇(C2H6O S) 。 3.1.1 1 鄰苯二甲醛(O P A,C8H6O2) 。 3.1.1 2 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。 3.2 溶液配制 3.2.1 甲酸水溶液(0.1%) : 吸取1m L甲酸, 加入到9 9 9m L水中, 混合均勻。 3.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。 3.2.3 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 2 3.2.4 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。 3.2.5 氫氧化鈉溶液(1m o l /L) : 準確稱取氫氧化鈉4. 0g, 溶于1 0 0m L 水, 混合均勻。 3.2.6 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用 9 8 0m L水溶解, 用鹽酸調(diào)整 p H 至7. 4, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 3.2.7 吐溫- 2 0/P B S溶液(0.1%) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(3.2.6) 并稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 3.2.8 硼砂溶液(0.0 5m o l /L, p H1 0.5) : 稱取硼砂1 9. 1g, 溶于9 8 0m L水中, 用氫氧化鈉溶液調(diào) p H 至 1 0.5, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 3.2.9 衍生溶液: 稱取2 .0g鄰苯二甲醛, 溶于2 0m L甲醇中, 用硼砂溶液(0 .0 5m o l /L, p H1 0 .5) (3 .2 .8 ) 稀 釋至5 0 0m L, 加入2 -巰基乙醇5 0 0L, 混勻, 裝入棕色瓶中, 現(xiàn)用現(xiàn)配。 3.3 標準品 3.3.1 伏馬毒素B1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 3.3.2 伏馬毒素B2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 3.3.3 伏馬毒素B3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 3.4 標準溶液配制 3.4.1 標準儲備溶液(0.1m g/m L) : 分別準確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒杯 中, 用乙腈-水溶液(3. 2.2) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光-2 0保 存。有效期6個月。 3.4.2 混合標準溶液: 準確吸取F B1標準儲備液1m L、F B2和F B3標準儲備液0.5m L至同一1 0m L 容量瓶中, 加乙腈-水溶液(3. 2.2) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度為5g/m L 的混合標準溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B 1濃度為1g /m L、 F B2和F B3濃度為0.5g/m L的混合標準 溶液。此溶液密封后避光4保存, 有效期6個月。 3.4.3 混合標準工作溶液: 準確吸取混合標準溶液, 用乙腈-水溶液(3.2.3) 稀釋, 配制成F B1濃度依次 為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、4 0 0n g/m L,F B 2和F B3濃度依次為 1 0n g /m L、 4 0n g /m L、 8 0n g /m L、 1 2 0n g /m L、 1 6 0n g /m L、 2 0 0n g /m L的系列混合標準工作溶液。 4 儀器和設備 4.1 高效液相色譜儀, 帶熒光檢測器。 4.2 柱后衍生系統(tǒng)。 4.3 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。 4.4 均質(zhì)器。 4.5 振蕩器。 4.6 氮吹儀。 4.7 離心機: 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。 4.8 免疫親和柱( 柱容量50 0 0n g,F B1柱回收率8 0%) ( 柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄B) 。 注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量檢驗。 4.9 微孔濾膜:0.4 5m, 有機型。 5 分析步驟 5.1 樣品制備 將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm, 混勻分成2份作 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 3 為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 在制樣的操作過程中, 應防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。 5.2 試樣提取 準確稱取固體樣品5g( 精確至0. 0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入2 0m L乙腈 -水溶液(3.2.2) , 渦旋或振蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。 玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。 5.3 試樣凈化 取2. 0m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(3.2.7) , 混合均勻后過免疫親和柱, 流速控制在 1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液(3.2.4) 洗 脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液, 5 5 下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(3.2.3) 溶解殘渣。渦旋 3 0s, 過0.4 5m微孔濾膜后, 收集于進樣瓶中, 待測。 注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實際操作時, 請參照廠商提供的操作說明和程序使用。 5.4 儀器參考條件 色譜柱: C1 8色譜柱:2 5 0mm4.6mm,5m, 或相當者。 檢測波長: 激發(fā)波長3 3 5n m; 發(fā)射波長4 4 0n m。 流動相:A: 甲酸水溶液( 3.2.1) ;B: 甲醇。梯度洗脫, 洗脫程序見表1。 流動相流速: 0.8m L/m i n。 衍生液流速: 0.4m L/m i n。 柱溫: 4 0。 反應器溫度: 4 0。 進樣量: 5 0L。 表1 流動相洗脫程序 時間 m i n 流動相A % 流動相B % 0.0 04 5.05 5.0 2.0 04 5.05 5.0 9.0 03 0.07 0.0 1 4.0 01 0.09 0.0 1 4.5 01 0.09 0.0 1 5.0 04 5.05 5.0 2 2.0 04 5.05 5.0 5.5 試樣溶液的測定 在5. 4項色譜條件下, 將5 0.0L系列伏馬毒素混合標準工作溶液(3.4.3) 按濃度從低到高依次注 入高效液相色譜儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標物質(zhì)的濃度為橫坐標( x軸) , 目標物質(zhì)的峰面積為縱坐 標( y軸) , 對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合, 標準工作曲線按式(1) 計算: G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 4 y=a x+b (1) 式中: y 目標物質(zhì)的峰面積比; a 回歸曲線的斜率; x 目標物質(zhì)的濃度; b 回歸曲線的截距。 標準工作溶液和樣液中待測物的響應值均應在儀器線性響應范圍內(nèi), 如果樣品含量超過標準曲線 范圍, 需稀釋后再測定。 5.6 空白試驗 不稱取試樣, 按5. 2和5.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。 6 分析結(jié)果的表述 待測樣品中F B 1、F B2、F B3的含量按式(2) 計算: X= ciVf m (2) 式中: X 待測樣品中F B1、F B2、F B3的含量, 單位為微克每千克( g / k g ) ; ci 待測物進樣液中F B1、F B2、F B3的濃度, 單位為納克每毫升( n g /m L) ; V 定容體積, 單位為毫升(m L) ; f 試液稀釋倍數(shù); m 樣品的稱樣量, 單位為克(g) 。 注:計算結(jié)果需扣除空白值, 測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。 7 精密度 樣品中伏馬毒素含量在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值 的2 0%。 8 其他 當稱樣量為5g時,F B 1、F B2、F B3的檢出限分別為1 7g / k g 、 8g/ k g 、 8g/ k g ; 定量限分別為 5 0g/ k g 、 2 5g/ k g 、 2 5g/ k g 。 第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 9 原理 樣品加入同位素內(nèi)標, 乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過免疫親和柱或強陰離子交換固相萃取柱凈化, 去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過高效液相色譜分離, 串聯(lián) 質(zhì)譜檢測, 同位素內(nèi)標法定量。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 5 1 0 試劑和材料 除非另有說明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。 1 0.1 試劑 1 0.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。 1 0.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。 1 0.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。 1 0.1.4 氯化鈉(N a C l) 。 1 0.1.5 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。 1 0.1.6 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。 1 0.1.7 氯化鉀(K C l) 。 1 0.1.8 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。 1 0.2 溶液配制 1 0.2.1 甲酸水溶液(0.1%) : 吸取1m L甲酸, 溶于1L水, 混合均勻。 1 0.2.2 乙腈-甲醇溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L甲醇和5 0 0m L乙腈, 混合均勻。 1 0.2.3 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。 1 0.2.4 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。 1 0.2.5 甲醇-水溶液(6 0+2 0) : 分別量取6 0 0m L甲醇和2 0 0m L水, 混合均勻。 1 0.2.6 甲醇-乙酸溶液(9 9+1) : 吸取1m L乙酸, 加入到9 9m L甲醇中, 混合均勻。 1 0.2.7 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。 1 0.2.8 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用 9 8 0m L水溶解, 用鹽酸調(diào)整 p H 至7. 4, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 1 0.2.9 吐溫- 2 0/P B S溶液(0 .1 %) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(1 0 .2 .8) 并稀釋至10 0 0m L, 混 合均勻。 1 0.3 標準品 1 0.3.1 F B1、F B2、F B3標準品 伏馬毒素B 1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 伏馬毒素B 2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 伏馬毒素B 3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 1 0.3.2 1 3C3 4-伏馬毒素B1、B2、B3同位素內(nèi)標 1 3C 3 4-伏馬毒素B1( 1 3C 3 4- F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 1 3C 3 4-伏馬毒素B2( 1 3C 3 4- F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 1 3C 3 4-伏馬毒素B3( 1 3C 3 4- F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 注:在檢測中可以只使用1 3C3 4- F B1一種同位素內(nèi)標, 但需要對被測定試樣基質(zhì)進行加標實驗, 評估和確定1 3C3 4- F B1 與其他被測伏馬毒素的基質(zhì)效應。或使用基質(zhì)匹配校正曲線。 1 0.4 標準溶液配制 1 0.4.1 標準儲備溶液(0.1m g/m L) : 分別準確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 6 杯中, 用乙腈-水溶液(1 0. 2.3) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0 m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光 -2 0保存。有效期6個月。 1 0.4.2 混合標準溶液: 準確吸取F B1標準儲備液1m L、F B2和F B3標準儲備液0.5m L至同一1 0m L 容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 0. 2.3) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度分別為 5g/m L的混合標準溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B1濃度為1g/m L、F B2和F B3濃度分別為0 .5g/m L 的混合標準溶液。此溶液密封后避光4保存。有效期6個月。 1 0.4. 3 混 合同位素標 準溶液: 準確 吸取1 3C3 4- F B1(2 5g/m L) 、 1 3C 3 4- F B2(1 0g /m L) 、 1 3C 3 4- F B3 ( 1 0g/m L) 各1m L至同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 0.2.3) 稀釋至刻度, 得到含1 3C3 4- F B1 2.5g/m L、 1 3C 3 4- F B2和 1 3C 3 4- F B31g /m L的混合同位素標準溶液。再稀釋1 0倍, 得到含1 3C 3 4- F B1 2 5 0n g /m L、 1 3C 3 4- F B2和 1 3C 3 4- F B31 0 0n g /m L的混合同位素標準工作溶液。有效期6個月。 1 0.4.4 混合標準工作溶液: 準確吸取混合標準溶液, 用乙腈-水溶液(1 0.2.4) 稀釋, 加入混合同位素標 準工作溶液( 1 0 .4 .3) , 配制成F B1濃度依次為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、 4 0 0n g /m L, F B2和F B3濃度依次為1 0n g/m L、4 0n g/m L、8 0n g/m L、1 2 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 0 0n g/m L 的系列混合標準工 作溶液, 每個 標準工作溶 液中含有1 3C 3 4- F B12 5n g /m L、 1 3C 3 4- F B2和 1 3C 3 4- F B3 1 0n g /m L。 1 1 儀器和設備 1 1.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀: 配有電噴霧離子源。 1 1.2 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。 1 1.3 均質(zhì)器。 1 1.4 振蕩器。 1 1.5 氮吹儀。 1 1.6 離心機: 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。 1 1.7 強陰離子交換固相萃取柱( 硅膠基,6m L,5 0 0m g) 。 1 1.8 免疫親和柱( 柱容量 50 0 0n g,F B1柱回收率 8 0 %) 。( 柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄B) 注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量檢驗。 1 1.9 微孔濾膜:0.2 2m, 有機型。 1 2 分析步驟 1 2.1 樣品制備 將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm, 混勻分成2份作 為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 在制樣的操作過程中, 應防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。 1 2.2 試樣提取 準確稱取固體樣品5g( 精確至0. 0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入混合同位素標準工作溶液 ( 1 0.4.3)4 0 0L, 加入2 0m L乙腈-水溶液(1 0.2.3) , 渦旋或振蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下 離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。 玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 7 1 2.3 試樣凈化 1 2.3.1 免疫親和柱凈化 取2. 0m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(1 0.2.9) , 混合均勻后過免疫親和柱, 流速控制在 1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液(1 0.2.8) 淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液 ( 1 0.2.7) 洗脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液,5 5下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(1 0.2.4) 溶解殘 渣。渦旋3 0s, 過0. 2 2m微孔濾膜后, 收集于進樣瓶中, 待測。 注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實際操作時, 請參照廠商提供的操作說明和程序使用。 1 2.3.2 強陰離子交換固相萃取柱凈化 取3m L提取液, 加入8m L甲醇-水溶液(1 0. 2.5) , 混合均勻后過強陰離子交換固相萃取柱( 使用前 按要求活化) , 分別用8m L甲醇-水溶液(1 0. 2.5) 和3m L甲醇淋洗, 用1 0m L甲醇-乙酸溶液(1 0.2.6) 洗 脫, 5 5下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(1 0.2.4) 溶解殘渣。渦旋3 0s, 過0.2 2m微孔濾膜后, 收 集于進樣瓶中, 待測。 1 2.4 儀器參考條件 1 2.4.1 液相色譜條件 色譜柱: C1 8柱,1 0 0mm2.1mm,1.7m, 或相當者。 流動相:A: 甲酸水溶液( 0.1%) ;B: 乙腈-甲醇溶液(5 0+5 0) 。梯度洗脫, 梯度見表2。 流速: 0.3 5m L/m i n。 柱溫: 3 0。 進樣量: 1 0L。 表2 流動相梯度洗脫程序 時間 m i n 流動相A % 流動相B % 0.0 07 0.03 0.0 2.3 03 0.07 0.0 4.0 03 0.07 0.0 4.2 001 0 0 4.8 001 0 0 5.0 07 0.03 0.0 1 2.4.2 質(zhì)譜參數(shù) 離子化模式: 電噴霧電離正離子模式( E S I +) 。 質(zhì)譜掃描方式: 多反應離子監(jiān)測(MRM) 。 監(jiān)測離子對信息見表3, 其他儀器參考條件見附錄C。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 8 表3 質(zhì)譜參數(shù) 毒素名稱母離子 定量 子離子 碰撞能量 e V 定性 子離子 碰撞能量 e V F B17 2 23 5 22 53 3 43 5 F B27 0 63 3 63 53 5 43 0 F B37 0 63 3 63 53 5 43 0 1 3C 3 4- F B17 5 63 7 43 53 5 64 0 1 3C 3 4- F B27 4 03 5 83 53 7 63 0 1 3C 3 4- F B37 4 03 5 83 53 7 63 0 1 2.5 定性判定 用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對樣品進行定性判定, 在相同試驗條件下, 樣品中應呈現(xiàn)定量離子對 和定性離子對的色譜峰, 被測物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液中對應物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時 間一致; 樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子相對豐度比的偏 差不超過表4規(guī)定范圍, 則可以判斷樣品中存在對應的目標物質(zhì)。 表4 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度( k)k5 0%5 0%k2 0%2 0%k1 0%k1 0% 允許的最大偏差 2 0%2 5%3 0%5 0% 1 2.6 定量測定 在5. 4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下, 將1 0.0L系列伏馬毒素混合標準溶液(1 0.4.4) 按濃度 從低到高依次注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標物質(zhì)和內(nèi)標的濃度比為橫坐標 ( x軸) , 目標物質(zhì)和內(nèi)標的峰面積比為縱坐標(y軸) , 對各個數(shù)值點進行最小二乘線性擬合, 標準工作 曲線按式( 3) 計算: y=a x+b (3) 式中: y 目標物質(zhì)/內(nèi)標的峰面積比; a 回歸曲線的斜率; x 目標物質(zhì)/內(nèi)標的濃度比; b 回歸曲線的截距。 標準工作溶液和樣液中待測物的響應值均應在儀器線性響應范圍內(nèi), 如果含量超過標準曲線范圍, 則重新取樣, 增加相應內(nèi)標添加量, 使內(nèi)標濃度與待測液濃度相匹配, 然后稀釋到適當濃度后分析。 1 2.7 空白試驗 不稱取試樣, 按1 2. 2和1 2.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 9 1 3 分析結(jié)果的表述 本方法采用內(nèi)標法定量。 含量按式( 4) 計算: X= cciAAsiV csiAiAsm (4) 式中: X 樣品中待測組分的含量, 單位為微克每千克( g / k g ) ; c 標準溶液中待測組分的濃度, 單位為納克每毫升( n g /m L) ; ci 測定液中待測組分的濃度, 單位為納克每毫升( n g /m L) ; A 測定液中待測組分的峰面積; Asi 標準溶液中內(nèi)標物質(zhì)的峰面積; V 定容體積, 單位為毫升(m L) ; csi 標準溶液中內(nèi)標物質(zhì)的濃度, 單位為納克每毫升( n g /m L) ; Ai 測定液中內(nèi)標物質(zhì)的峰面積; As 標準溶液中待測組分的峰面積; m 樣品稱樣量, 單位為克( g) 。 注:計算結(jié)果需扣除空白值, 測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。 1 4 精密度 樣品中伏馬毒素含量在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值 的2 0%。 1 5 其他 當稱樣量為5g時,F B 1、F B2、F B3的檢出限分別為7g / k g 、 3g/ k g 、 3g/ k g ; 定量限分別為 2 0g/ k g 、 1 0g/ k g 、 1 0g/ k g 。 第三法 免疫親和層析凈化-柱前衍生高效液相色譜法 1 6 原理 樣品用乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過免疫親和柱凈化, 去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干 擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過O P A衍生后進高效液相色譜分離, 熒光檢測, 外標法定量。 1 7 試劑和材料 除非另有說明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。 1 7.1 試劑 1 7.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 1 0 1 7.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。 1 7.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。 1 7.1.4 氫氧化鈉(N a OH) 。 1 7.1.5 氯化鈉(N a C l) 。 1 7.1.6 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。 1 7.1.7 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。 1 7.1.8 氯化鉀(K C l) 。 1 7.1.9 硼砂(N a2B4O71 0 H2O) 。 1 7.1.1 0 2 -巰基乙醇(C2H6O S) 。 1 7.1.1 1 鄰苯二甲醛(O P A,C8H6O2) 。 1 7.1.1 2 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。 1 7.2 溶液配制 1 7.2.1 甲酸銨-甲酸水溶液(0.1m o l /L, p H : 3.3) : 稱取6.3g甲酸銨, 溶于9 8 0m L水中, 用甲酸調(diào) p H 至3. 3, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 1 7.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。 1 7.2.3 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。 1 7.2.4 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。 1 7.2.5 氫氧化鈉(1m o l /L) 溶液: 準確稱取氫氧化鈉4. 0g, 溶于1 0 0m L 水, 混合均勻。 1 7.2.6 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用 9 8 0m L水溶解, 然后用鹽酸調(diào)整 p H 至7. 4, 最后用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。 1 7.2.7 吐溫- 2 0/P B S溶液(0 .1 %) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(1 7 .2 .6) 并稀釋至10 0 0m L, 混 合均勻。 1 7.2.8 硼砂溶液(0.1m o l /L) : 稱取硼砂3. 8g, 用水溶解并稀釋至1 0 0m L, 混合均勻。 1 7.2.9 衍生溶液: 準確稱取4 0m g鄰苯二甲醛, 溶于1m L的甲醇中, 用硼砂溶液(0.1m o l /L) ( 1 7.2.8) 5m L稀釋, 加入2 -巰基乙醇5 0L, 混合均勻, 裝入棕色瓶中, 現(xiàn)用現(xiàn)配。 1 7.3 標準品 F B1、F B2、F B3標準品: 伏馬毒素B 1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 伏馬毒素B 2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 伏馬毒素B 3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標準溶液。 1 7.4 標準溶液配制 1 7.4.1 標準儲備溶液(0.1m g/m L) : 分別準確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒 杯中, 用乙腈-水溶液( 1 7 .2 .2) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光- 2 0保 存。有效期6個月。 1 7.4.2 混合標準溶液: 準確吸取F B1標準儲備液1m L、F B2和F B3標準儲備液各0 .5m L至同一1 0m L 容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 7. 2.2) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度分別為 5g/m L的混合標準溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B1濃度為1g/m L、F B2和F B3濃度為0.5g/m L的 混合標準溶液。此溶液密封后避光4保存, 有效期6個月。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 1 1 1 7.4.3 混合標準工作液: 準確吸取混合標準溶液, 用乙腈-水溶液(1 7.2.3) 稀釋, 配制成F B1濃度依次 為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、4 0 0n g/m L,F B 2和F B3濃度依次為 1 0n g /m L、 4 0n g /m L、 8 0n g /m L、 1 2 0n g /m L、 1 6 0n g /m L、 2 0 0n g /m L的系列混合標準工作溶液。 1 8 儀器和設備 1 8.1 高效液相色譜儀, 帶熒光檢測器。 1 8.2 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。 1 8.3 均質(zhì)器。 1 8.4 振蕩器。 1 8.5 氮吹儀。 1 8.6 離心機: 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。 1 8.7 免疫親和柱( 柱容量 50 0 0n g,F B1柱回收率 8 0 %) ( 柱容量及柱回收率驗證方法參見附錄A.2) 。 注:對于每個批次的親和柱在使用前需進行質(zhì)量驗證。 1 8.8 微孔濾膜:0.4 5m, 有機型。 1 8.9 秒表。 1 9 分析步驟 1 9.1 樣品制備 將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機磨碎并細至粒度小于1mm, 混勻分成2份作 為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標識后置于4下避光保存。 在制樣的操作過程中, 應防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。 1 9.2 試樣提取 準確稱取固體樣品5g( 精確至0. 0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入2 0m L乙腈 -水(1 7.2.2) , 渦旋 或震蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。 玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。 1 9.3 試樣凈化 取2. 0m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(1 7.2.7) , 混合均勻后過免疫親和柱, 流速控制在 1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液(1 7.2.4) 洗 脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液, 5 5下氮吹至干, 加入5 0 0L乙腈-水溶液(1 7.2.2) 溶解殘渣。渦旋 3 0s, 過0.4 5m微孔濾膜后, 收集于進樣瓶中, 待測。 注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實際操作時, 請參照廠商提供的操作說明和程序使用。 1 9.4 衍生 取1 0 0L標準溶液或樣品溶液于進樣瓶中, 加入1 0 0L衍生溶液(1 7. 2.9) , 渦旋混合3 0s, 在 2m i n內(nèi)進樣分析。 G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 1 2 1 9.5 儀器參考條件 色譜柱: C1 8柱,1 5 0mm4.6mm,5m或相當者。 檢測波長: 激發(fā)波長3 3 5n m; 發(fā)射波長4 4 0n m。 流動相:A: 甲酸銨-甲酸水溶液( 1 7.2.1) ;B: 甲醇。梯度洗脫, 洗脫程序見表5。 流速: 1.0m L/m i n。 柱溫: 4 0。 進樣量: 5 0L。 表5 流動相洗脫程序 時間 m i n 流動相A % 流動相B % 0.0 03 0.07 0.0 5.0 02 8.07 2.0 6.0 02 5.07 5.0 1 1.0 02 2.07 8.0 1 1.1 03 0.07 0.0 1 6.0 03 0.07 0.0 1 9.6 試樣溶液的測定 在1 2. 4色譜條件下, 將5 0.0L伏馬毒素系列混合標準工作溶液(1 7.4.3) 按濃度從低到高依次注 入高效液相色譜儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標物質(zhì)的濃度為橫坐標( x軸) , 目標物質(zhì)的峰面積為縱坐 標( y軸) , 對各個數(shù)據(jù)點進行最小二乘線性擬合, 標準工作曲線: y=a x+b (5) 式中: y 目標物質(zhì)的峰面積比; a 回歸曲線的斜率; x 目標物質(zhì)的濃度; b 回歸曲線的截距。 標準工作溶液和樣液中待測物的響應值均應在儀器線性響應范圍內(nèi), 如果樣品含量超過標準曲線 范圍, 需稀釋后再測定。 1 9.7 空白試驗 不稱取試樣, 按1 9. 2和1 9.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質(zhì)。 2 0 分析結(jié)果的表述 X= ciVf m (6) 式中: X 待測樣品中F B1、F B2、F B3的含量, 單位為微克每千克( g / k g ) ; G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 1 3 ci 待測物進樣液中F B1、F B2、F B3的濃度, 單位為納克每毫升( n g /m L) ; V 定容體積, 單位為毫升(m L) ; f 試液稀釋倍數(shù); m 樣品的稱樣量, 單位為克(g) 。 注:計算結(jié)果需扣除空白值, 測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。 2 1 精密度 樣品中伏馬毒素含量在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值 的2 0%。 2 2 其他 當稱樣量為5g時,F B 1、F B2