GB 5009.276-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T9 6 9 5.1 72 0 0 8 肉與肉制品 葡萄糖酸- -內(nèi)酯含量的測定 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T9 6 9 5.1 72 0 0 8相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的測定” ; 增加了第一法的檢出限、 定量限; 修改了5.1中試樣制備的方法; 增加了“ 第二法 高效液相色譜法” 。G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 61 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的測定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中葡萄糖酸- -內(nèi)酯含量的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于肉與肉制品、 豆制品、 飲料中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的測定, 第二法適用于食品中葡萄糖酸- -內(nèi)酯含量的測定。第一法 分光光度計(jì)法2 原理用沸水提取試樣中的葡萄糖酸- -內(nèi)酯, 過濾上清液, 在氫氧化鉀作用下葡萄糖酸- -內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸鹽。葡萄糖酸鹽通過葡萄糖酸激酶和6 -磷酸葡萄糖脫氫酶的作用, 產(chǎn)生5 -磷酸核酮糖并使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NA D P) 還原。用分光光度計(jì)測量還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的吸光度, 然后計(jì)算出葡萄糖酸- -內(nèi)酯的含量。葡萄糖酸鹽+腺嘌呤核苷三磷酸葡萄糖酸激酶6-磷酸葡萄糖酸鹽+二磷酸腺苷6-磷酸葡萄糖酸鹽+NA D P6-磷酸葡萄糖脫氫酶5-磷酸核酮糖+NA D P H+C O2+H+3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的三級水。3.1 試劑3.1.1 無水乙醇(C2H6O) 。3.1.2 石油醚: 沸程3 06 0。3.1.3 氫氧化鉀(KOH) 。3.1.4 雙甘氨肽(C4H8N2O3) 。3.1.5 氯化鎂(M g C l2) 。3.1.6 碳酸氫鈉(N a HC O3) 。3.1.7 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽(C2 1H2 7N7N a O1 7P3) 。3.1.8 腺嘌呤核苷三磷酸鈉鹽(C1 0H1 4N5N a2O1 3P3) 。3.1.9 6 -磷酸葡萄糖脫氫酶( 活力,1 1 0U/m g) 。3.1.1 0 葡萄糖酸激酶( 活力,1 3U/m g) 。3.2 試劑配制3.2.1 氫氧化鉀溶液(2m o l/L) : 稱取1 1.2 2g于5 0m L小燒杯中, 加水溶解后轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶,G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 62 定容。3.2.2 緩沖液: 分別稱取雙甘氨肽2.6 4g和氯化鎂0.2 8 4g溶于1 5 0m L水中, 用氫氧化鉀溶液調(diào)p H至8.0, 定容到2 0 0m L容量瓶( 可在4下保存4周) 。3.2.3 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NA D P) 溶液(1 0m g/m L) : 稱取煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽5 0m g于帶蓋的小瓶中, 用5.0m L水溶解( 可在4下保存4周) 。3.2.4 腺嘌呤核苷三磷酸(AT P) 溶液(5 0m g/m L) : 稱取腺嘌呤核苷三磷酸鈉鹽2 5 0m g和碳酸氫鈉2 5 0m g于帶蓋的小瓶中, 加入5.0m L水溶解( 可在4下保存4周) 。3.2.5 6 -磷酸葡萄糖脫氫酶(6 - P G DH) 溶液(2.0m g/m L) : 每毫升6 -磷酸葡萄糖脫氫酶(6 - P G DH) 懸液中含有6 - P G DH2.0 m g, 葡萄糖酸激酶和還原型NA D P氧化酶不超過0. 0 5%( 可在4 下保存6個(gè)月) 。 3.2.6 葡萄糖酸激酶(GK) 溶液(1.0m g/m L) : 每毫升葡萄糖酸激酶(GK) 懸液中含有GK1.0m g,NA D P氧化酶含量不超過0.0 5%( 可在4下保存6個(gè)月) 。4 儀器和設(shè)備4.1 紫外可見分光光度計(jì)。4.2 分析天平: 感量1m g和0.1m g。4.3 勻質(zhì)機(jī)。5 分析步驟5.1 試樣制備5.1.1 肉與肉制品、 豆制品等固體樣品取有代表性的樣品不少于2 0 0g, 用勻質(zhì)機(jī)制成勻漿。制成后的試樣應(yīng)盡快分析, 若不立即分析, 應(yīng)密封冷凍貯存。貯存的試樣在啟用時(shí)應(yīng)重新混勻。5.1.2 飲料等液體樣品搖勻后直接取樣。5.2 提取肉制品: 稱取2g 1 0g( 精確至0.0 0 1g) 試樣于5 0m L燒杯中, 加入1 0m L石油醚洗滌, 用玻璃棒攪拌均勻, 靜置1 5m i n后, 用干燥濾紙過濾, 重復(fù)洗滌三次。再用1 0m L無水乙醇洗滌三次。然后將濾紙上殘?jiān)D(zhuǎn)移至原小燒杯中, 加3 0m L水煮沸, 待冷卻后用氫氧化鉀溶液(2m o l/L) 調(diào)至溶液p H為1 0, 用水定容至1 0 0m L容量瓶。過濾, 濾液待上機(jī)用。豆制品: 稱取2g 1 0g( 精確至0.0 0 1g) 試樣于5 0m L燒杯中, 加3 0m L水提取, 煮沸, 冷卻后用氫氧化鉀溶液(2m o l/L) 調(diào)至溶液p H為1 0.0, 用水定容至1 0 0m L容量瓶。過濾, 濾液待上機(jī)用。飲料: 過濾, 準(zhǔn)確吸取3 0 m L濾液用氫氧化鉀溶液(2 m o l/L) 調(diào)至溶液p H為1 0, 用水定容至1 0 0m L容量瓶, 待上機(jī)用。5.3 測定取兩個(gè)1c m比色皿, 一個(gè)為試驗(yàn)皿, 一個(gè)為空白皿。分別按序加入緩沖液(3.2.2)2.5 0m L、NA D P溶液(1 0m g/m L)0.1m L和AT P溶液(5 0m g/m L)0.1m L, 加蓋混勻; 分別在試驗(yàn)皿中加入提取液0.2m L, 空白皿中加入水0.2m L, 加蓋混勻。再分別加入6 - P G DH溶液(2.0m g/m L)0.0 5m L, 加蓋混G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 63 勻后放置5m i n, 以空白為參比在3 6 5n m或3 4 0n m波長處測吸光度。A1 試驗(yàn)溶液的吸光度值;A1 B 空白溶液的吸光度值。取G K溶液(1 .0m g/m L)0 .0 1m L分別置于上述兩個(gè)比色皿中, 立即混勻。1 0s 1 5s內(nèi)在3 6 5n m或3 4 0n m波長處測吸光度。以后每隔2m i n測一次, 直到吸光度恒定為止。繪制出吸光度值與時(shí)間的關(guān)系曲線, 并查出吸光度最大值。A2 試驗(yàn)溶液的吸光度最大值;A2 B 空白溶液的吸光度最大值。6 分析結(jié)果的表述試樣中葡萄糖酸- -內(nèi)酯含量按式(1) 計(jì)算:X=0.9 0 8 A2.9 61 9 6.1K0.210 0 01 0 010 0 01 0 0m=5.2 7 05AK0.2m(1) 式中:X 試樣中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的含量,%;0.9 0 8 葡萄糖酸- -內(nèi)酯與D -(+)-葡萄糖酸相對分子量的比值;A (A2-A1)-(A2 B-A1 B) ;2.9 6 比色液總體積, 單位為毫升(m L) ;1 9 6.1 D -(+)-葡萄糖酸的相對分子量;K 摩爾吸光系數(shù), 在3 6 5n m波長時(shí),K= 3 .5 0c m2/m o l; 在3 4 0n m波長時(shí),K= 6 .2 3c m2/m o l;0.2 制備比色液所用提取液的體積, 單位為毫升(m L) ;10 0 0 單位換算系數(shù);1 0 0 提取液的定容體積, 單位為毫升(m L) ;1 0 0 小數(shù)與百分?jǐn)?shù)之間的換算系數(shù);m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) 。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。8 其他當(dāng)稱樣量為1 0g時(shí), 方法檢出限為0.0 0 75%, 定量限為0.0 2 5%。第二法 高效液相色譜法9 原理葡萄糖酸- -內(nèi)酯在水中緩慢水解生成葡萄糖酸和少量的葡萄糖酸- -內(nèi)酯并達(dá)到水解平衡。試樣經(jīng)水煮沸、 提取、 定容、 過濾, 用高效液相色譜分離。通過待測液中葡萄糖酸的峰面積與葡萄糖酸- -內(nèi)G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 64 酯標(biāo)準(zhǔn)水解為葡萄糖酸的峰面積比較, 采用外標(biāo)法定量計(jì)算試樣中的葡萄糖酸- -內(nèi)酯的含量。1 0 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 0.1 試劑1 0.1.1 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。1 0.1.2 磷酸(H3P O4) 。1 0.2 試劑配制磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液: 稱1.3 6g磷酸二氫鉀加0.5m L磷酸用水溶解后定容至1L。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖酸- -內(nèi)酯(C6H1 0O6,C A S號:9 0 - 8 0 - 2) : 純度9 8%。1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5.0m g/m L)準(zhǔn)確稱取0.2 5 0g葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品( 精確至0.1m g) , 用水加熱煮沸提取, 冷卻后定容至5 0m L容量瓶。1 0.4.2 葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)系列工作液依次吸取0.5 0m L、1.0 0m L、2.0 0m L、5.0 0m L、1 0.0m L葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5.0m g/m L) 于1 0 0.0m L容量瓶中, 用磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液分別定容至刻度, 得到濃度分別為0.0 2 5m g/m L、0.0 5m g/m L、0.1 0m g/m L、0.2 5m g/m L、0.5 0m g/m L的葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 高效液相色譜儀, 配示差折光檢測器。1 1.2 天平: 感量1m g和0.1m g。1 1.3 勻質(zhì)機(jī)。1 2 分析步驟1 2.1 試樣制備固體或半固體樣品使用勻質(zhì)機(jī)粉碎, 液體樣品用勻漿機(jī)打成勻漿。制成后的試樣應(yīng)盡快分析, 若不立即分析, 應(yīng)密封冷凍貯存。貯存的試樣在啟用時(shí)應(yīng)重新混勻。1 2.2 提取稱取2g 1 0g( 精確至0.0 0 1g) 試樣于5 0m L燒杯中, 加3 0m L磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液煮沸提取, 冷卻后用磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液定容至1 0 0m L容量瓶, 放置2h后經(jīng)0.4 5m水相微孔濾膜過濾, 濾液待上機(jī)用。G B5 0 0 9.2 7 62 0 1 65 1 2.3 儀器參考條件1 2.3.1 色譜柱: 有機(jī)酸柱, 柱長4.6mm, 內(nèi)徑2 5 0mm, 膜厚5m, 或分離效果相當(dāng)?shù)钠渌枘z鍵合柱。1 2.3.2 柱溫:3 0。1 2.3.3 示差檢測器檢測池溫度:3 5。1 2.3.4 流動相: 磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液。1 2.3.5 流速:0.8m L/m i n。1 2.3.6 進(jìn)樣量:1 0L。1 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中, 測定相應(yīng)的葡萄糖酸峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為橫坐標(biāo), 以峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖見圖A.1。1 2.5 試樣溶液的測定將試樣溶液注入高效液相色譜儀中, 得到葡萄糖酸峰面積, 與葡萄糖酸- -內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)水解為葡萄糖酸的峰面積比較, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中的葡萄糖酸- -內(nèi)酯的含量。1 3 分析結(jié)果的表述試樣中葡萄糖酸- -內(nèi)酯含量按式(2) 計(jì)算:X=V10 0 0m1 0 0(2) 式中:X 試樣中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的含量,%; 試樣溶液中葡萄糖酸- -內(nèi)酯的濃度, 單位為毫克每毫升(m g/m L) ;V 提取液的定容體積, 單位為毫升(m L) ;m 試樣的質(zhì)量,