病毒與細(xì)胞間的相互作用.ppt

第四章 病毒與細(xì)胞間的相互作用,第一節(jié) 病毒的細(xì)胞培養(yǎng) 第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用,第一節(jié) 病毒的細(xì)胞培養(yǎng),病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物（動(dòng)物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)）。,一、動(dòng)物接種,接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo)。,按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜。,動(dòng)物接種的優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)：（1）不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備； （2）技術(shù)簡(jiǎn)單； （3）易成功,缺點(diǎn)：（1）個(gè)體差異大 （2）價(jià)格昂貴 （3）數(shù)量有限 （4）需要隔離畜舍,二、雞胚接種,一種比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法。,卵殼,殼膜,雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單、來源充沛、價(jià)格低廉、數(shù)量可大， 不需特殊設(shè)備,缺點(diǎn)：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動(dòng)物的病毒。,細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。,三、細(xì)胞培養(yǎng),每個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等 無個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好 可嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作 細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征 應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化,優(yōu)點(diǎn)：,根據(jù)細(xì)胞來源、染色體特征及傳代次數(shù)，可分為三種類型： 原代細(xì)胞：動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。 二倍體細(xì)胞：將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱為二倍體細(xì)胞。 傳代細(xì)胞：能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成。,（一）細(xì)胞的類型,（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法,靜置培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)室常用。細(xì)胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長(zhǎng)分裂，最后長(zhǎng)成單層。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞貼附于玻瓶四周，長(zhǎng)成單層。,第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用,殺細(xì)胞感染 非殺細(xì)胞感染 引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無影響。 產(chǎn)生干擾素,由病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。CPE能在光學(xué)顯微鏡下觀察。 細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等； 細(xì)胞聚合，如腺病毒； 細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒； 有些病毒能形成包涵體。,一、病毒引致的殺細(xì)胞變化,（一）細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),正常細(xì)胞,CPE,CPE觀察,正常單層A72細(xì)胞,接種CCV后出現(xiàn)細(xì)胞拉網(wǎng) 的的單層A72細(xì)胞,CPE觀察,CPE觀察,正常單層A72細(xì)胞,接種犬冠狀病毒（CCV）后形成合胞體的的單層A72細(xì)胞,合胞體（syncytia）是病毒感染后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜消失，成為多核巨細(xì)胞。,能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力。,50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）,（二）空斑試驗(yàn),將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見，此即空斑試驗(yàn)。,空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類似于細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位（PFU）。病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU來表示。,CELLS,空斑試驗(yàn)的用途：,1. 測(cè)定病毒數(shù)量 2. 純化病毒 單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。 3. 鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。,（三）包涵體（inclusion body),定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。,包涵體的性質(zhì),病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體 大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體 細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體,狂犬病毒包涵體（Negri body）,定義：由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類：、干擾素。 抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。 干擾素作用具有宿主特異性，而無病毒特異性。,二、干擾素（IFN）