蔗糖酶理論講授-2.ppt

1,三、實(shí)驗(yàn)步驟及原理,1、蔗糖酶的提取 2、蔗糖酶的純化 3、各純化級(jí)別蔗糖酶的活性測(cè)定 4、各純化級(jí)別蔗糖酶的蛋白質(zhì)含量測(cè)定 5、正交試驗(yàn)法測(cè)定不同條件對(duì)蔗糖酶活性的影響 6、蔗糖酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 7、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量,2,1、蔗糖酶的提取 (細(xì)胞破壁) 自溶法破壁（本實(shí)驗(yàn)）,干酵母粉,溶于蒸餾水,乙酸鈉,乙酸乙酯,35恒溫,攪拌40分鐘,35恒溫過夜,補(bǔ)加蒸餾水,攪拌均勻，成糊狀,離心,棄沉淀及脂層,E1,記錄生產(chǎn)廠家和批號(hào) 用硫酸紙封嚴(yán)（過夜）,3,2、蔗糖酶的純化,4,1. 酶的蛋白屬性； 2. 調(diào)節(jié)酶溶解度的方法； 有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀 3. 根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法； 透析、凝膠層析 4. 根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法； 離子交換層析 5. 根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的方法;,酶的純化方法,5,2. 調(diào)節(jié)酶溶解度的方法；,酶的純化方法,（1）改變離子強(qiáng)度； 鹽溶 / 鹽析 硫酸銨分級(jí)沉淀（反抽提法） （2）改變pH或溫度； （3）改變介電常數(shù)；,有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。 親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。 親水性有機(jī)溶劑的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了表面水化膜的厚度，降低其親水性，導(dǎo)致脫水凝集。,6,有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀操作條件的控制 溶劑選擇 常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機(jī)溶劑的選擇主要應(yīng)考慮沉淀作用強(qiáng)、對(duì)生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。 溫度 使用有機(jī)溶劑沉淀生物大分子時(shí)應(yīng)控制在低溫下進(jìn)行。 樣品濃度的控制 一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初始濃度為 0.5%-2% 為好。,7,3. 根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法；,酶的純化方法,（1）離心分離； （2）透析、超濾； （3）凝膠層析 （gel chromatography）,凝膠層析的定義： 凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析 凝膠層析 常見名稱：凝膠過濾、分子篩層析、排阻層析、凝膠滲透層析。,8,凝膠層析的基本原理,凝膠層析是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，其原理是分子篩效應(yīng)，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。 在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長(zhǎng)、流速慢，以至最后流出柱外。,9,4. 根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法；,酶的純化方法,離子交換層析 基本原理 ： 以離子交換劑為固定相，以特定的離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑；帶負(fù)電物質(zhì)用陰離子交換劑,10,3、蔗糖酶的活性測(cè)定 酶活力 (enzyme activity) 酶催化某一反應(yīng)的能力V,V單位時(shí)間內(nèi)單位體積中 底物 (substrate) 的減少量或 產(chǎn)物 (product) 的增加量,11,國(guó)際單位（IU）：在特定的條件下，每分鐘催化1mol 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 催量單位（kat）：在特定條件下，每秒鐘使1mol底物轉(zhuǎn) 化為產(chǎn)物所需的酶量。,1 IU= 16.6710-9 kat,酶活力單位：,2、酶活力和比活力表示方式,12,活力 (或總活力)涉及在樣品中酶的總單位，而比活力是酶純度的量度，是每毫克酶的催化活力數(shù) (U/mg蛋白)。在酶的純化過程中它的比活力逐漸升高，當(dāng)酶提純時(shí)，其比活力值成為最大和恒定。,酶的比活力 (specific activity，也稱比活性）,比活力：指每mg蛋白質(zhì)所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白質(zhì)來表示。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） 比活力有時(shí)也可用每g或每ml 酶含多少個(gè)活力單位來表示,13,DNS 法測(cè)定蔗糖酶活力（本實(shí)驗(yàn)）,1、 3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理：,2） 在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成一定比例關(guān)系（可于比色測(cè)定），所以可用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量。,1）,2、 蔗糖酶活力測(cè)定的原理： 1）蔗糖酶催化的反應(yīng)是： 2）蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。(附1) 3）該方法是半微量定糖法，操作簡(jiǎn)便、快速、雜質(zhì)干擾較少。,蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖,蔗糖酶,14,3、 DNS比色定糖法工作曲線的制作： 取8支血糖管編號(hào)1-8，按下頁(yè)表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2mg/ml）、蒸餾水、3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時(shí)放入沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘（注意：一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大燒杯代替沸水浴鍋），取出后立即用流動(dòng)的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測(cè)定540nm處的吸光度值。 以葡萄糖(mg)含量為橫坐標(biāo)、A540值為縱坐標(biāo)，畫出工作曲線。,15,蔗糖酶活力的測(cè)定： 操作： 取兩支試管分別加入用 pH4.6, 0.2mol/L 的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋過的酶液 2ml，一支中加入 0.5ml 1mol/L的 NaOH，搖勻，使酶失活（做對(duì)照），另一支做測(cè)定管；把兩支試管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 水浴中預(yù)熱恒溫；分別取 2ml 5% 的蔗糖加入上述兩試管中，并準(zhǔn)確計(jì)算時(shí)間，3 分鐘后于測(cè)定管中加入 0.5ml 1mol/L 的 NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。 從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水揚(yáng)酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測(cè)光密度。 在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到所測(cè)定光密度值對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計(jì)算酶活力： E = (葡萄糖mg數(shù)(4.5/0.5)E的稀釋倍數(shù)/2ml)/2,16,紫 外 吸 收 法,雙 縮 脲 法,Folin-酚法 (Lowry法),4、蔗糖酶的蛋白濃度測(cè)定,17,這是測(cè)定蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一，由于方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，常為實(shí)驗(yàn)室所采用，也是文獻(xiàn)上用得最多的方法之一。,Folin-酚法 (Lowry法),(A) 凡含有兩個(gè)及兩個(gè)以上肽鍵 (-CO-NH-) 的化合物在堿性溶液中 (如 Folin-甲試劑) 都能與 Cu2+ 作用，形成紫色的復(fù)合物； (B) 所有的蛋白質(zhì)均可與 Folin-甲試劑反應(yīng)形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物； (C) 銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在 pH=10 的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸 (Folin-乙 試劑) 還原成蘭色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物，其顏色的深淺 (在一定范圍內(nèi)) 與蛋白質(zhì)的含量成正比。,干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受它們的影響更大。 （附2）,原理:,18,三種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較,19,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) (Orthogonal experimental design) 是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，它是從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是分式析因設(shè)計(jì)的主要方法。 是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。日本著名的統(tǒng)計(jì)學(xué)家田口玄一將正交試驗(yàn)選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。,5、正交試驗(yàn)法測(cè)定不同條件對(duì)蔗糖酶活性的影響,20,6、蔗糖酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)，是酶工程研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。,21,1、影響酶促反應(yīng)速度的因素 pH值 溫度 酶濃度 底物濃度 激活劑 抑制劑,22,2、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式米氏學(xué)說,S： 底物濃度 m： 米氏常數(shù) Vmax：最大反應(yīng)速度 V： 不同S時(shí)的反應(yīng)速度,Michaelis L and Menten ML.,. Biochem Z. 1913, 49: 333369.,23,米氏常數(shù)（Km）的意義,Km值是酶的特征常數(shù)之一，只跟酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。 Km值作為常數(shù)只是對(duì)一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而言，測(cè)定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。 1/ Km可以表示酶對(duì)底物親和力的大小, 1/ Km越大, 表明親和力越大, 多底物酶有不同的 Km值, 最適底物的Km值最小。,24,3、抑制劑對(duì)酶活性的影響,使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用。 能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑。 酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)： 在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。 能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體。,25,抑制劑的作用方式,不可逆抑制 抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制 抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。 根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為兩類（競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制),26,可逆抑制,(1) 竟?fàn)幮砸种?某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。 竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭(zhēng)能力來消除。 加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km 變大，酶促反應(yīng)Vmax不變。,27,酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭(zhēng)與酶活性中心結(jié)合，所以稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。 如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km 不變，但由于Vmax減小，所以酶促反應(yīng)速度也下降了。,可逆抑制,(1) 非竟?fàn)幮砸种?28,5、蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定（本實(shí)驗(yàn)） 1）將離子交換柱層析得的E3稀釋(pH4.6 HAC緩沖液)至30U/mL，共16ml。 2）取試管8支，按07編號(hào)，0為對(duì)照管。 3）按P146頁(yè)表將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。 4）取16ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。 5）于各管中依次按同樣時(shí)間間隔加入已保溫過的酶液2ml，記時(shí)，立即搖勻。在35水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min。 6）按同樣次序和時(shí)間間隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。 7）吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS試劑和1.5ml去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測(cè)定A540值,29,7、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,Sodium Dodecyl Sulfate, Polyacrylamid Gel Electrophoresis, SDS-PAGE,30,電泳：是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向 泳動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)：指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。,電泳？,31,蛋白質(zhì)分子狀態(tài)在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電荷的分子, 在電場(chǎng)下向自身電荷相反的方向移動(dòng)。,32,3.按比例配好分離膠,用移液槍快速加入，距梳齒下緣約1cm，之后加少許蒸餾水，靜置直到膠與水層間出現(xiàn)清晰界面。 加速劑TEMED要在注膠前加入，否則凝結(jié)無法注膠。 注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。 水封的目的是為了使分離膠膠面平整，并排除氣泡。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。 4. 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加 入濃縮膠至短玻璃板上緣0.5cm處，迅速插入樣梳,靜置直到膠凝好。 樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。,實(shí)驗(yàn)過程,33,5. 在上槽內(nèi)加入電極緩沖液，拔出樣梳。 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，保證電流通暢。 6.用移液槍距槽底三分之一處加樣。加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 進(jìn)樣要緩慢，不要使樣品漂出泳道外面。 移液槍不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散。 為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔注樣。,實(shí)驗(yàn)過程,34,7. 電泳槽中加入緩沖