Production of the Promoter of Le(Length gene) in Garden Pea---（豌豆Le啟動(dòng)子的功能研究）.docx

豌豆Le啟動(dòng)子的功能研究Production of the Promoter of Le(Length gene) in Garden Pea摘要 用PCR的方法從豌豆總DNA中克隆了Le基因（length gene）的啟動(dòng)子，命名為L(zhǎng)e啟動(dòng)子。Northern 雜交的結(jié)果證明，Le基因主要在豌豆的根、莖中表達(dá)，在花和葉中的表達(dá)量很少，而果實(shí)中幾乎沒(méi)有表達(dá)。根據(jù)Le基因伸長(zhǎng)組織特異的表達(dá)圖式，推測(cè)Le基因的啟動(dòng)子為伸長(zhǎng)組織特異的啟動(dòng)子。GFP基因作為報(bào)告基因，由Le啟動(dòng)子調(diào)控，在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉片的熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以及用GFP基因作為探針，轉(zhuǎn)基因煙草的Northern雜交的結(jié)果，證實(shí)了Le啟動(dòng)子的組織特異性。利用Le啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的組織特異表達(dá)，在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上都有重要的應(yīng)用價(jià)值。Abstract Stem length is one of the seven traits of garden pea from which Gregor Mendel established the laws of inheritance. The length gene (Le) encodes 3-hydroxylase, which controls the GA1 biosynthesis from GA20 in pea. GA1 is the major gibberellin (GA) controlling stem elongation in pea (Pisum sativum L.). The Northern Blotting analysis showed the tissue-specific expression of Le gene in roots and shoots, using the coding sequence of Le gene as a probe. Based on the result, the promoter of Le gene shoLd have tissue-specificity. Using PCR (Polymerase Chain Reaction), we cloned the promoter of Le gene (Le promoter) from the genomic DNA of G2 pea. Under the control of the Le promoter, the GFP gene was expressed in tobacco. Using the GFP gene as a probe, the Northern Blotting analysis of transgenic tobacco showed that the GFP gene expressed specifically in roots and shoots, especially in younger roots and shoots. The result identified the Le promoter is an elongating-tissue-specific promoter. Using the promoter, we can realize the elongating-tissue-specific expression of the foreign genes.關(guān)鍵詞Le基因，Le啟動(dòng)子，GFP基因, 伸長(zhǎng)組織特異前言Le 基因孟德?tīng)栐诮⑦z傳法則的過(guò)程中研究了豌豆的七個(gè)表型性狀（種子的形狀，種子和花的顏色，子葉的顏色，豆莢的形狀，豆莢的顏色，花的位置，莖的高矮），莖的高矮（stem length）是其中之一。1917年，White發(fā)現(xiàn)莖的高矮決定于一種高度因子是否存在，并引入基因符號(hào)Le（Length）。隱性等位基因le的純合體植株，與野生型Le的純合體植株相比，莖節(jié)間距較短，植株矮小，高度只有Le植株的1/4 -1/5。Brain和Hemming第一次將豌豆莖的高矮和赤霉素的作用（GA，gibberellins）聯(lián)系在一起，給豌豆芽施加GA3，可刺激原本矮小的豌豆莖干伸長(zhǎng)。Brain認(rèn)為高莖豌豆中通常會(huì)產(chǎn)生與赤霉素相似的內(nèi)源物質(zhì)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。赤霉素作為一種重要的植物激素，在莖干的伸長(zhǎng)，種子的萌發(fā)和發(fā)育過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用。豌豆中控制莖干伸長(zhǎng)的赤霉素主要是GA1，由GA20經(jīng)過(guò)3-羥化酶的羥化作用形成。1984年Ingram等人通過(guò)放射性標(biāo)記的方法，發(fā)現(xiàn)GA20向GA1的轉(zhuǎn)化作用在le（矮干）植株內(nèi)比在Le（高干）植株內(nèi)大大降低了；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，le植株內(nèi)GA20的含量很高，而Le植株內(nèi)GA1的含量很高；由此認(rèn)為，Le基因編碼了赤霉素3-羥化酶（3-hydroxylase）。1997年David等克隆了赤霉素3-羥化酶基因的cDNA，同年，Diane等人通過(guò)篩選豌豆的亞基因組文庫(kù)，得到了Le基因及其兩側(cè)的序列。David等人對(duì)Le基因的研究證明它的表達(dá)具有組織特異性，在正在萌發(fā)的豌豆中，Le基因在根、莖和子葉中特異表達(dá)；在萌發(fā)后的豌豆中，Le基因在幼根、幼莖和節(jié)間中特異表達(dá)。根據(jù)Le基因組織特異的表達(dá)模式，可以推斷它的啟動(dòng)子是一個(gè)伸長(zhǎng)組織特異的啟動(dòng)子。植物基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子是基因5末端與RNA聚合酶及一些反式作用因子結(jié)合的區(qū)域。一般情況下，基本啟動(dòng)子含有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TATA-box結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)一般為A, TATA-box的序列為T(mén)ATAA/TAA/T，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-25-30bp之間。RNA聚合酶II和啟動(dòng)子結(jié)合后開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。由于啟動(dòng)子中的順式作用元件在基因的特異表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用，可使目的基因在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段或特定的環(huán)境條件下得到表達(dá)。因此，可通過(guò)連入特異啟動(dòng)子，獲得基因表達(dá)的時(shí)空特異性。特異啟動(dòng)子的類型主要有：環(huán)境相應(yīng)啟動(dòng)子，如：光響應(yīng)啟動(dòng)子、溫度響應(yīng)啟動(dòng)子等；激素響應(yīng)啟動(dòng)子，如：GA響應(yīng)啟動(dòng)子、ABA響應(yīng)啟動(dòng)子等；組織特異啟動(dòng)子，如：種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子等。研究植物啟動(dòng)子常用的報(bào)告基因有GUS（-glucuronidase），CAT（chloramphenical acetyl transferase），LUC（luciferase）和GFP（green fluorescent protein）。用于啟動(dòng)子-報(bào)告基因表達(dá)特異性檢測(cè)的系統(tǒng)有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化檢測(cè)，基因槍轟擊后的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因植物的穩(wěn)定表達(dá)檢測(cè)。 煙草和水稻是常用的模式植物，分別代表雙子葉和單子葉植物。通常啟動(dòng)子的分離和分析在不同的植物中進(jìn)行，因此分析發(fā)現(xiàn)的結(jié)果可能不能完全代表它在原植物中的特性，但在雙子葉或是單子葉植物中間，啟動(dòng)子的組織特異性無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)采用GFP作為報(bào)告基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草，驗(yàn)證了Le 啟動(dòng)子的伸長(zhǎng)組織特異性。GFP報(bào)告基因綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）最早是由Shimomura等（1962年）在海洋生物水母（Aequorea victoria）中發(fā)現(xiàn)的（Chalfie etal，1994）。GFP蛋白的多肽鏈中含有特殊的生色團(tuán)結(jié)構(gòu)，可在紫外光源下發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光。GFP的這種熒光發(fā)射無(wú)需外加輔助因子或進(jìn)行任何特殊處理，作為報(bào)告基因和分子探針有很大的優(yōu)越性，所以目前被廣泛地用于生化和細(xì)胞生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。GFP基因表達(dá)產(chǎn)物只需長(zhǎng)波紫外和藍(lán)光激發(fā)即可顯示熒光，對(duì)它的檢測(cè)不會(huì)影響對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能的檢測(cè)，所以可以方便地進(jìn)行活體和生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。轉(zhuǎn)化的受體組織細(xì)胞和整個(gè)個(gè)體都可以用手持紫外燈觀察，對(duì)亞細(xì)胞水平的觀察利用普通的熒光顯微鏡即可。材料和方法實(shí)驗(yàn)材料1. 植物材料G2豌豆（Pisum sativum L）：由PJ Davies教授（Cornell University）贈(zèng)種，實(shí)驗(yàn)室培育。2. 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌（Escherichia coli）DH5，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101：實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)中間載體pCAMBIA 3300：澳大利亞國(guó)際農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心惠贈(zèng)（Center for the Application of MolecLar Biology to International AgricLture）。中間載體pAVA120：由PJ Davies教授惠贈(zèng)。3. 酶和試劑盒植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit），植物核DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）：QIAGEN公司產(chǎn)品。pGEM-T Easy Vector Systems：Promega 公司產(chǎn)品。質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System）：Promega 公司產(chǎn)品。DNA回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit）：QIAGEN公司產(chǎn)品。核酸限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment：Promega公司產(chǎn)品。Taq DNA Polymerase：鼎國(guó)，華美公司產(chǎn)品隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒（Random Primer DNA Labeling Kit）：Takaba公司產(chǎn)品。4. Northern Blotting 試劑Loading Dye （20mL）：80mg Bromophenol Blue（0.4%），80mg Xyiene Cyanole（0.4%），40L 0.5M EDTA（1mM），10mL Glyceol（50%），10mL H2O。10MSE（1升，pH7.0）：41.8g MOPS(free acid)，3.72g Na2EDTA2H2O，6.8g NaAcetate3H2O，加水定容至1000mL。20SSC（1升，pH7.0）：175.3g NaCl，88.2g NaCitrate，加水定容至1000mL。雜交液：1% BSA，1mM EDTA，0.5M NaPhosphate(pH7.2)，7% SDS。Washing medium 1：1% BSA，1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，5% SDS。Washing medium 2：1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，1% SDS。5. 煙草轉(zhuǎn)化試劑1/2 MS 培養(yǎng)液 (1000ml，pH5.8)：2.2g MS，15g sucrose，加水定容至1000mL。MS 固體培養(yǎng)基 (1000ml，pH5.8)：4.4g MS，30g sucrose，8g Agar，加水定容至1000mL。T1培養(yǎng)基（pH5.6-5.8）：MS 固體培養(yǎng)基，1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA。T2培養(yǎng)基：T1培養(yǎng)基，500mg/L Carb。T3培養(yǎng)基：T1培養(yǎng)基，10mg/mL PPT。T4培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，10mg/mL PPT。6-BA母液（1mg/mL）：1mol/mL HCl 溶解，用水定容。NAA母液（1mg/mL）：95% 乙醇溶解，用水定容。6. PCR引物均由GIBCO BRL公司合成，序列如下：LP（Le Promoter，Le 啟動(dòng)子）合成引物L(fēng)P1（5 Primer）38bpATGGT ACCGT CGTAA AGAAT GGTTG AAGAT GGTTG ATGLP2（3 Primer）38bpGCTCT AGAGT AAAAG TAGTA GCTAT AGAGA AAATA ATGLGP（Le Gene Probe，Le基因探針）合成引物L(fēng)GP1（5 Primer）25bpTAGTG AAAGT GACAT AGCAA ATTTGLGP2（3 Primer）24bpGAATA GTAAT TTTGG CATTA ATTG7. 溶液和培養(yǎng)基各種溶液和培養(yǎng)基配方見(jiàn)分子克隆。實(shí)驗(yàn)方法1. 提取G2豌豆總核DNA用植物核DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）。稱取100mgG2豌豆葉片，用液氮將其研磨成粉末后，迅速轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，使液氮揮發(fā)。加入400L Buffer AP1和4L RNase A stock solution（100mg/mL），劇烈振蕩至看不到明顯的組織塊。65水浴10min，間或顛倒混合2-3次。加入130L Buffer AP2，混合，冰浴5min。將懸液（連同生成的沉淀）上柱（QIAshredder spin column），最大轉(zhuǎn)速離心2min。將清液移入1.5mL離心管，加入0.5倍體積的Buffer AP3，1倍體積的無(wú)水乙醇，混勻。轉(zhuǎn)移650L混合液上柱（DNeasy mini spin column），10，000rpm離心1min，棄下清。加入500L Buffer AW，10，000rpm離心1min，棄下清。加入500L Buffer AW，最大轉(zhuǎn)速離心2min。把柱子轉(zhuǎn)到1.5mL離心管上，加入100L65預(yù)熱的Buffer AE洗脫，室溫下放置5min，10，000rpm離心1min。2. 準(zhǔn)備Le 基因的探針1) PCR擴(kuò)增Le基因片斷根據(jù)Le 基因的全序列設(shè)計(jì)引物，序列見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料部分。以提取的G2豌豆的核DNA為模板，PCR克隆Le基因部分編碼序列，作為Northern Blotting分析的探針。50L PCR反應(yīng)混合液，37L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer（含MgCl2），1L LGP1，1L LGP2，4L G2核DNA，1L Taq DNA polymerase。PCR反應(yīng)條件，94預(yù)變性5min；94變性45s，55退火1.5min，72延伸1min，循環(huán)30次；72再延伸10min。2) PCR產(chǎn)物回收8%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，用DNA回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit），回收600bp的DNA片斷。在紫外燈下切下含有DNA片斷的膠塊，稱重（每100mg重量對(duì)應(yīng)于100L體積）。加入3倍體積的Buffer AW，65水浴10min，間或顛倒混勻。加入1倍體積的異丙醇，混勻后吸取800L上柱。13，000rpm離心1min，倒去濾液。加入750L Buffer AP，13，000rpm離心1min，倒去濾液，13，000rpm再離心1min。將柱子轉(zhuǎn)至1.5mL離心管上，加入30L Buffer EB，室溫放置1min后，最大轉(zhuǎn)速離心1min。3) 連入T vector用pGEM-T Easy Vector Systems將回收的PCR產(chǎn)物和T vector相連。短暫離心pGEM-T Easy Vector，使用0.5mL離心管，制備10L連接反應(yīng)混合液，5L 2Rapid Ligation Buffer，1L pGEM-T Easy Vector，3L PCR產(chǎn)物，1L T4 DNA Ligase。4連接過(guò)夜（18小時(shí)）。4) 轉(zhuǎn)化制備DH5感受態(tài)。100L DH5感受態(tài)加入10L連接產(chǎn)物，冰上放置30min，42熱激2min，冰上放置5min。加入800L LB液體培養(yǎng)基，37保溫30min。12,000rpm離心1min，倒去大部分上清，用剩余的100L左右的LB液體培養(yǎng)基懸浮細(xì)菌沉淀，涂板（涂有40L X-Gal和4L IPTG）。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB固體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素）上，37培養(yǎng)14小時(shí)。5) 提質(zhì)粒，酶切鑒定挑取單個(gè)菌落，接種于3mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)，37振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。提取質(zhì)粒，酶切鑒定后得到陽(yáng)性克隆。6) 酶切得到Le基因片斷用EcoRI酶切質(zhì)粒，反應(yīng)混合液，2L 10酶切緩沖液，2L BSA，1L EcoRI，6L質(zhì)粒DNA，9L ddH2O。37酶切6小時(shí)，電泳回收酶切片斷，即為L(zhǎng)e基因探針DNA。3. Le 基因的Northern Blotting 分析1) 提取植物各組織總RNA用植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取豌豆各組織的RNA。稱取G2豌豆的葉片，莖，根，花，果實(shí)各100mg，分別用液氮研磨成粉末后，迅速轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，使液氮揮發(fā)。加入450L Buffer RLT，劇烈振蕩。56水浴1-3min。裂解液上柱QIAshredder spin column，最大轉(zhuǎn)速離心2min，轉(zhuǎn)移清液至1.5mL離心管。加入0.5倍體積（約225L）無(wú)水乙醇，槍頭混勻。將675L樣品（包括生成的沉淀）上柱RNeasy mini spin column，10，000rpm離心15s，棄下清。加入700L Buffer RW1，10，000rpm離心15s洗滌，棄下清（連同收集管）。把柱子轉(zhuǎn)移到新的收集管上，加入500L Buffer RPE，10，000rpm離心15s，棄下清。加入500L Buffer RPE，最大轉(zhuǎn)速離心2min，棄下清（連同收集管）。把柱子轉(zhuǎn)到1.5mL離心管上，加入30L RNase-free的水，10，000rpm離心1min，重復(fù)5次，每種樣品各得到150LRNA溶液。取出15L，稀釋50倍，測(cè)定光吸收。其余樣品加入3倍體積無(wú)水乙醇，-70保存。2) 電泳準(zhǔn)備用去污劑、自來(lái)水和蒸餾水順序洗滌電泳槽、梳子和膠板，無(wú)水乙醇干燥后，用3%H2O2浸泡，然后用RNase free的水清洗。稱取1.2g瓊脂糖加入100mL1MSE，熔化后水浴冷卻至65。加入1L EB，1.8mL甲醛，混勻后倒膠（厚度不超過(guò)4mm），凝膠40min。3) RNA樣品準(zhǔn)備保存的RNA樣品，加入1倍體積的0.3M NaAC，-20沉淀30min。4 12，000rpm離心15min，加入750L 70%乙醇洗滌，4 12，000rpm離心5min，冷凍干燥后，溶解于5L RNase free的水中。每種樣品取相應(yīng)體積（保證總RNA量相同），加入2L 10MSE，3.5L甲醛，10L甲酰胺，65水浴15min，加入2L Loading Dye。4) 電泳加樣電泳3小時(shí)左右，電泳距離6-8cm。電泳緩沖液為1MSE，電泳中間，每隔0.5小時(shí)將正負(fù)兩極緩沖液混合一次。電泳后將膠浸入ddH2O中，紫外燈下檢查RNA的完整性。5) 轉(zhuǎn)膜根據(jù)膠的大小，剪出相應(yīng)大小的NC膜，把膜浸入ddH2O中5min，取出浸入20SSC中5min。同時(shí)，把“stack tray”放在桌面上，調(diào)水平；放上20張干燥的GB004濾紙，其上放置4張干燥的GB002濾紙，其上放置1張?jiān)?0SSC中潤(rùn)濕的GB002濾紙，在潤(rùn)濕的GB002濾紙上平鋪潤(rùn)濕的NC膜，在它的上面平鋪電泳膠（GB002濾紙，NC膜和電泳膠之間不要有氣泡）。在膠的上面加上20SSC，放上3張潤(rùn)濕的GB002濾紙；放上“buffer tray”，槽內(nèi)加入125mL 20SSC，放上“buffer wick”，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。在2SSC中洗膜5min，把膜放在濾紙上，吸去殘余的溶液。紫外交聯(lián)儀中自動(dòng)交聯(lián)。濾紙包膜，外加錫箔紙，80烘烤2小時(shí)，4保存。6) 預(yù)雜交，標(biāo)記探針用2mL注射器，裝G50的柱子。用RNase-free的水洗雜交瓶，用雜交液潤(rùn)洗雜交瓶3次，放入膜，加入100mL雜交液，預(yù)雜交0.5小時(shí)。同時(shí)，準(zhǔn)備用標(biāo)記反應(yīng)液，2L Le基因探針DNA（200ng），2L Random Primer,10L TE Buffer；95水浴3min后迅速置于冰中冷卻，放置5min；加入2.5L 10Buffer，2.5L dNTP Mixture，5L 用于標(biāo)記的dCTP（50uCi），加水定容至24L，加入1L Exo-free Klenow Fragment；37反應(yīng)15min。加入3L溴芬蘭，混勻，上柱（G50），加入800L TE洗脫，收集溴芬蘭前的溶液，95加熱3min后迅速置于冰中冷卻，立即用于雜交。7) 雜交在雜交瓶中加入25mL 65預(yù)熱的雜交液，加入探針后混勻，65雜交16-24小時(shí)。8) 洗膜65預(yù)熱洗液，用Washing medium 1洗2次，每次5min；用Washing medium 2洗3-5次，每次5min，用計(jì)數(shù)器監(jiān)測(cè)膜的放射性強(qiáng)度變化，決定洗膜的次數(shù)。9) 壓片洗膜后室溫下將膜自然晾干（30-60min），包上一層保鮮膜，和x光片一起放入壓片夾中，-70壓片16-72小時(shí)。洗片前將壓片夾于室溫晾干1-2小時(shí)后，暗室洗片。4. Le 啟動(dòng)子的克隆1) PCR克隆Le啟動(dòng)子根據(jù)Le基因及其上游序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)P1、LP2，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料部分。PCR克隆Le基因上游1.1kb的DNA片斷，分析表明含有Le基因的啟動(dòng)子。50L PCR反應(yīng)混合液，34L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，4L G2核DNA，1L Taq DNA polymerase。 PCR反應(yīng)條件，94預(yù)變性5min；94變性45s，60退火1.5min，72延伸1min，循環(huán)30次；72再延伸10min。2) 連接，回收，轉(zhuǎn)化用pGEM-T Easy Vector Systems將回收的PCR產(chǎn)物和T vector相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板，藍(lán)白斑篩選和抗性篩選得到陽(yáng)性斑，提取質(zhì)粒，酶切鑒定得到陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒命名為pGEM-LP。六合通公司測(cè)序鑒定。5. 植物表達(dá)中間載體的構(gòu)建1) 酶切，回收用XbaI，EcoRI限制性內(nèi)切酶雙切pGEM-LP載體，EcoRI端補(bǔ)平。首先用0.5L EcoRI酶切質(zhì)粒，65加熱終止反應(yīng)；冷卻后加入1L Klenow酶，1L dNTP，室溫下放置30min，65加熱終止反應(yīng)；冷卻后加入0.5L XbaI酶切質(zhì)粒。電泳回收1.1kb酶切片斷。使用XbaI，SmaI限制性內(nèi)切酶雙切pCAMBIA3300質(zhì)粒，電泳回收酶切后的質(zhì)粒片段。2) 連接將Le啟動(dòng)子的酶切回收產(chǎn)物和pCAMBIA3300質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物混合，加樣如下：1L 10連接緩沖液，1L T4連接酶，4L Le啟動(dòng)子回收產(chǎn)物，4L pCAMBIA3300，16連接過(guò)夜。3) 轉(zhuǎn)化，鑒定制備DH5感受態(tài)。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，涂板。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB固體培養(yǎng)基（含卡那霉素）上，37培養(yǎng)14小時(shí)。挑取單個(gè)菌落，接種于3mL LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素），37振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。提取質(zhì)粒，酶切鑒定后得到陽(yáng)性克隆，新合成的載體命名為pLP。4) 構(gòu)建中間載體pLP-GFP用EcoRI，PstI限制性內(nèi)切酶雙切pAVA120載體，EcoRI端補(bǔ)平。電泳回收1kb的酶切片斷。使用XbaI，PstI限制性內(nèi)切酶雙切pLP質(zhì)粒，電泳回收酶切后的質(zhì)粒片段。連接，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，酶切鑒定后得到陽(yáng)性克隆，新的中間載體命名為pLP-GFP。6. 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1) 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)28，在LB液體培養(yǎng)基（含有慶大霉素）中振蕩培養(yǎng)農(nóng)桿菌（GV3101）24小時(shí)。1：100轉(zhuǎn)接，28振蕩培養(yǎng)6-7小時(shí)，至OD600為0.6。制備感受態(tài)。取1.5mL菌液，13，000rpm離心30s，棄上清。用800L 250mMCaCl2重懸菌體沉淀，13，000rpm離心30s，棄上清。用100L 250mM CaCl2重懸沉淀，冰上放置4小時(shí)。2) 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。在100L農(nóng)桿菌感受態(tài)中加入6L pLP-GFP質(zhì)粒，冰上放置30min，浸入液氮中5min，37水浴5min。加入4-6倍體積的LB液體培養(yǎng)基， 28溫育3-5小時(shí)后，涂板，在LB固體培養(yǎng)基（含卡那霉素和慶大霉素）上，28培養(yǎng)24小時(shí)。3) 鑒定陽(yáng)性克隆挑取單個(gè)菌落，接種于3mLLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素和慶大霉素），28振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。提取質(zhì)粒，酶切鑒定后得到陽(yáng)性克隆。7. 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得1) 制備農(nóng)桿菌懸液將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基（含慶大霉素和卡那霉素）中，28振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)，取5ml菌液4，000g離心10min，用1/2MS培養(yǎng)液洗滌菌體，再離心，菌體懸浮于20-40ml 1/2MS液體中（OD600=0.5）。2) 葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草取培養(yǎng)好的無(wú)菌煙草小苗的葉片，剪成1cm2左右的小塊，放入準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌懸液中，浸泡3-5min。取出葉塊，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在鋪有一層無(wú)菌濾紙的T1培養(yǎng)基上，在28暗培養(yǎng)48小時(shí)后，將葉塊轉(zhuǎn)入T2培養(yǎng)基中，25-28光下培養(yǎng)24 小時(shí)。將葉塊轉(zhuǎn)入T3培養(yǎng)基中，25-28光下培養(yǎng)，約15天后葉塊切口處有愈傷生成，25-28繼續(xù)培養(yǎng)，每10天左右換一次新鮮培養(yǎng)基，愈傷逐漸分化形成芽點(diǎn)，2-3月后，芽長(zhǎng)成3-5cm高的小苗。切下較大的植株，轉(zhuǎn)入T4培養(yǎng)基中，10天左右開(kāi)始有根生成，待根系發(fā)達(dá)時(shí)，將苗轉(zhuǎn)入滅菌土中，置溫室培養(yǎng)。8. PCR鑒定提取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的總DNA為模板，以Le啟動(dòng)子的引物L(fēng)P1，LP2為引物，進(jìn)行PCR分析。50L PCR反應(yīng)混合液，34L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，4L 煙草核DNA，1L Taq DNA polymerase。PCR反應(yīng)條件，94預(yù)變性5min；94變性45s，60退火1.5min，72延伸1min，循環(huán)30次；72再延伸10min。同時(shí)，以pLP質(zhì)粒為模板，以Le啟動(dòng)子的引物L(fēng)P1，LP2為引物，PCR作為對(duì)照。50L PCR反應(yīng)混合液，37.5L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，0.5L 質(zhì)粒DNA，1L Taq DNA polymerase。反應(yīng)條件同上。PCR產(chǎn)物電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖5 f9. 轉(zhuǎn)基因煙草的Northern Blotting分析1) 制備探針用XbaI，NcoI限制性內(nèi)切酶雙切pAVA120載體，電泳回收1kb左右的GFP基因酶切片斷，用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒（Random Primer DNA Labeling Kit）標(biāo)記后用作探針。2) Northern Blotting用植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit）分別從轉(zhuǎn)基因煙草的莖（幼莖、老莖），根（幼根、老根），葉和節(jié)間中提取各組織的RNA。電泳后轉(zhuǎn)膜，以GFP基因?yàn)樘结樳M(jìn)行雜交，放射自顯影后得到雜交結(jié)果，見(jiàn)圖10. 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因煙草的葉片取轉(zhuǎn)基因煙草無(wú)菌苗的頂端葉片，取葉尖、葉緣部分，切成小片；在載玻片上滴50%的甘油一滴，將葉片展放于載片中間，放上蓋玻片（盡量避免氣泡）。立即置于20倍熒光顯微鏡下觀察，照相。結(jié)果與討論Le 基因的Northern Blotting 結(jié)果分析Northern Blotting 結(jié)果顯示，在光照條件下生長(zhǎng)的豌豆中，Le基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根和莖中大量存在，在葉中只有少量的存在，在花和幼嫩的種子中不存在；在暗中培養(yǎng)的黃化豌豆中，Le基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根和莖中的含量特別豐富。（見(jiàn)附圖3 b）根和莖是植物主要的伸長(zhǎng)組織，二者均通過(guò)細(xì)胞的伸長(zhǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)；而葉，花和種子則主要是通過(guò)細(xì)胞數(shù)量的增加進(jìn)行生長(zhǎng)，細(xì)胞基本不伸長(zhǎng)；暗中培養(yǎng)的黃化苗，表型上存在十分明顯的伸長(zhǎng)現(xiàn)象，根、莖細(xì)而長(zhǎng)。Northern Blotting 的結(jié)果證實(shí)了Le基因伸長(zhǎng)組織特異的表達(dá)模式，根據(jù)啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可以推測(cè)Le基因的啟動(dòng)子也具有伸長(zhǎng)組織的特異性。Le啟動(dòng)子的克隆Le基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游80bp處，含有TATA-box，（），對(duì)照Le基因的cDNA序列和核DNA及其上游序列，可知TATA-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-34bp處，含有TATA-box的上游序列為L(zhǎng)e基因的啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物L(fēng)P1、LP2，克隆Le基因上游1.1kb的序列，并在DNA序列的5端和3端分別添加KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)。六合通公司測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果和已知序列比較，核苷酸序列相同，認(rèn)為得到了Le基因的啟動(dòng)子，命名為L(zhǎng)e Promoter。Le啟動(dòng)子的序列及測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附圖2，7。植物表達(dá)中間載體的構(gòu)建構(gòu)建流程圖見(jiàn)附圖1。pCAMBIA3300植物表達(dá)載體，具有除草劑（phosphinothricin，簡(jiǎn)稱PPT）和卡那霉素（kanamycin）兩個(gè)不同的抗性基因，分別用于真核、原核生物內(nèi)的篩選。在多克隆位點(diǎn)連入Le啟動(dòng)子，通過(guò)酶切和PCR進(jìn)行鑒定（見(jiàn)附圖4 b,c），結(jié)果證實(shí)，成功構(gòu)建了新的植物表達(dá)載體pLP。pLP帶有伸長(zhǎng)組織特異啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)目的基因在伸長(zhǎng)組織中的特異表達(dá)。來(lái)自中間載體pAVA120的GFP報(bào)告基因，已經(jīng)改造并在基因的5端連有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子（TL），可在植物細(xì)胞中高效率的表達(dá)。將其連入載體pLP，獲得新的植物表達(dá)載體pLP-GFP，酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)附圖4 d。利用載體pLP-GFP可以獲得轉(zhuǎn)基因植物，利用GFP報(bào)告基因進(jìn)行Le啟動(dòng)子的表達(dá)特異性檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因煙草的獲得通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因的煙草。煙草轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)附圖5 a-e。以LP1，LP2為引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果（見(jiàn)附圖5 f）顯示，pLP質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因煙草PCR產(chǎn)物為1.1kb的條帶，與Le啟動(dòng)子大小一致；野生型煙草的PCR產(chǎn)物沒(méi)有特異的條帶，該結(jié)果證實(shí)已獲得含有Le啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)Le啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)的檢測(cè)需進(jìn)一步的Southern Blotting結(jié)果（實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行）。表達(dá)特異性檢測(cè)Northern Blotting 結(jié)果（見(jiàn)附圖6 e）顯示，轉(zhuǎn)基因煙草中，GFP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在根和莖中含量豐富，在葉中只有少量的存在；GFP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在幼根和幼莖中的含量又明顯高于老根和老莖。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，葉毛中可觀察到明顯的綠色熒光，但在葉片細(xì)胞中看不到明顯的綠色熒光；同樣的，在熒光顯微鏡下觀察野生型煙草的葉片，葉毛和葉片細(xì)胞中都不能觀察到綠色熒光。結(jié)果見(jiàn)附圖6 a-d。葉片的生長(zhǎng)主要通過(guò)細(xì)胞數(shù)量的增加實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞伸長(zhǎng)的現(xiàn)象不明顯；而葉毛屬于表皮毛，是由表皮細(xì)胞的伸長(zhǎng)形成的。上述結(jié)果證實(shí)，Le啟動(dòng)子確實(shí)是一個(gè)伸長(zhǎng)組織特異的啟動(dòng)子。研究意義克隆得到的Le啟動(dòng)子是一個(gè)伸長(zhǎng)組織特異的啟動(dòng)子，對(duì)葉片細(xì)胞觀察的結(jié)果初步證明該啟動(dòng)子具有伸長(zhǎng)細(xì)胞的特異性。利用Le啟動(dòng)子可以實(shí)現(xiàn)外源基因在伸長(zhǎng)組織，或是非伸長(zhǎng)組織伸長(zhǎng)細(xì)胞中的特異表達(dá)?？蓮V泛用于有關(guān)伸長(zhǎng)組織或細(xì)胞的理論研究中。蟲(chóng)害一直是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因之一，通過(guò)基因工程的手段將抗蟲(chóng)基因引入農(nóng)作物細(xì)胞并使其穩(wěn)定的表達(dá)和遺傳，從而培育抗蟲(chóng)作物新品種，獲得農(nóng)作物的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。一般情況下，抗蟲(chóng)基因的作用是通過(guò)表達(dá)毒蛋白實(shí)現(xiàn)的，所以，在提高作物抗性的同時(shí)，必須注意轉(zhuǎn)基因作物的食用安全性。通過(guò)特異的啟動(dòng)子，有目的的實(shí)現(xiàn)抗蟲(chóng)基因在特定組織中的特異表達(dá)，是利用基因工程手段獲得抗蟲(chóng)作物最為理想而有效的方式。Le啟動(dòng)子正是具有這樣的組織特異性，可以預(yù)計(jì)它在基因工程的實(shí)踐中會(huì)有重要的用途。圖例圖1 植物表達(dá)中間載體構(gòu)建流程圖 a.pLP中間載體構(gòu)建；b.pLP-GFP中間載體構(gòu)建圖2 Le啟動(dòng)子的克隆圖3 豌豆的Northern Blotting分析 a. Northern Blotting轉(zhuǎn)膜示意圖；b.豌豆Northern Blotting結(jié)果圖4 PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物電泳圖 a.Le啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物；b.酶切鑒定中間載體pLP；c.PCR鑒定中間載體pLP ；d.酶切鑒定中間載體pLP-GFP圖5 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得 a.未轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片；b.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片在T3培養(yǎng)基上長(zhǎng)出愈傷；c. 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片在T3培養(yǎng)基上長(zhǎng)出小苗；d.轉(zhuǎn)化的煙草小苗在T4培養(yǎng)基中生根；e.初步長(zhǎng)成的轉(zhuǎn)化煙草；f.轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定圖6 表達(dá)特異性檢測(cè) a.野生型煙草葉片在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；b.圖a的局部放大；c.轉(zhuǎn)基因煙草葉片在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；d.圖c的局部放大；e.轉(zhuǎn)基因煙草Northern Blotting結(jié)果圖7 Le啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果致謝首先感謝李政道先生和秦惠女士為我提供這樣好的機(jī)會(huì)，使我可以在本科生期間就參與到學(xué)科前沿的實(shí)驗(yàn)研究工作中。兩年來(lái)，在獨(dú)立承擔(dān)科研任務(wù)的過(guò)程中，我的理論水平和實(shí)踐能力都有了質(zhì)的飛躍，樹(shù)立了初步的科研思想，掌握了豐富的實(shí)驗(yàn)技能，具備了一定的科研能力。這將為我今后進(jìn)一步的科學(xué)研究工作打下一個(gè)良好的基礎(chǔ)。師恩難忘，是導(dǎo)師朱玉賢教授的悉心指導(dǎo)，把我一步步帶進(jìn)生命科學(xué)的殿堂。他對(duì)科研工作火一般的熱情和忘我的拚搏精神時(shí)刻激勵(lì)著我前進(jìn)的腳步，他嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和淵博的生物學(xué)知識(shí)幫我培養(yǎng)起良好的科研品質(zhì)。兩年來(lái)，朱博的關(guān)懷和教誨時(shí)刻鼓舞著我，幫我戰(zhàn)勝實(shí)驗(yàn)中的一次次的困難和挫折，讓我懂得做人、做學(xué)問(wèn)的道理。參考文獻(xiàn)1 David N, et al. Mendels dwarfing gene: cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 890789112 DR Lester, et al. Mendels stem length gene (Le) encodes a gibberellin 3 beta-hydroxylase. Plant Cell. 1997, 9: 1435-14433 Diane R, et al. The influence of the null le-2 mutation on gibberellin levels in developing pea seeds. Plant Growth Regulation. 1999, 27: 83-894 Jacquel