雞屎藤離體快繁培養(yǎng)基的篩選

凱里學(xué)院本科畢業(yè)論文 學(xué)科代碼： 學(xué) 號(hào)： 2009407045 本科畢業(yè)論文設(shè)計(jì)題目：雞屎藤離體快繁培養(yǎng)基的篩選學(xué) 院： 環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物科學(xué) 班 級(jí)： 2009級(jí) 學(xué)生姓名： 宋念念 指導(dǎo)教師： 任峻 2013年 4月 9日目 錄目 錄I摘要II關(guān)鍵詞IIAbstract.IIKey wordsII1 前言12 材料與方法22.1 試驗(yàn)材料22.2 試驗(yàn)方法22.2.1培養(yǎng)基的配置22.2.2滅菌22.2.3開啟無菌操作臺(tái)中的紫外滅菌燈22.2.4準(zhǔn)備試驗(yàn)材料32.2.5接種32.2.6初代培養(yǎng)32.2.7 繼代培養(yǎng)33結(jié)果與分析93.1 MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織93.2初代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析93.3 MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基上繼代的培養(yǎng)物104結(jié)論10參考文獻(xiàn)10致謝12雞屎藤離體快繁培養(yǎng)基的篩選宋念念（凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院 貴州凱里 556011）摘要：【目的】找出適合雞屎藤離體快繁的最佳培養(yǎng)基?！痉椒ā恳噪u屎藤的葉作為試驗(yàn)材料，采用MS培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)，觀察并記錄愈傷組織的分化狀況，計(jì)算誘導(dǎo)率?！窘Y(jié)果】MS培養(yǎng)基最適合雞屎藤離體快繁，培養(yǎng)基其次，培養(yǎng)基效果最不明顯。關(guān)鍵詞：雞屎藤；離體快繁；誘導(dǎo)率Paederia scandens in vitro rapid propagation medium selectionSong Niannian(Environment and life science, Kaili university, Kaili，Guizhou 556011)Abstract: Objective to found out the suitable Paederia scandens in vitro Rapid Propagation of optimal culture medium, method the Paederia scandens leaves as test material, using MS medium, B5 medium, N6 medium for tissue culture, observe and record the differentiation of callus induction rate conditions, calculation of. results MS culture medium for micropropagation of Paederia scandens, B5 medium secondly, N6 medium effect was the most obvious.Key words: Paederia scandens; micropropagation; induction rateI1 前言雞屎藤(Paederia scandens)系茜草科雞屎藤屬多年生蔓性草質(zhì)藤本植物，別名雞矢藤，牛皮凍1。主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及其南部地區(qū)。常生長(zhǎng)在氣候濕熱的灌木叢和荒坡郊野。雞屎藤既可入藥，有消食祛風(fēng)濕、活血消腫功效2，其嫩莖葉又是廣東、海南一帶居民喜歡吃的美味野菜。據(jù)分析，它的葉子含有多種成分揮發(fā)油3。由于雞屎藤的葉被揉爛后常常發(fā)出一股雞屎的臭味，因此而得名。雞屎藤的抗壞血酸含量很高，遠(yuǎn)高于一般的水果及蔬菜，礦質(zhì)元素含量也很豐富，氨基酸的種類搭配齊全、合理，是一種聚營(yíng)養(yǎng)、藥用功能于一體的珍貴野菜資源之一。雞屎藤全株都可以入藥，因?yàn)樗须u屎藤苷（paederoside）及車葉草苷（asperulosede）等多種成分。其味甘酸、性平。在我國(guó)，雞屎藤植物資源豐富，在山東、江蘇、福建、廣東、湖北、四川、貴州、云南等省都有分布。在外國(guó)，印度、馬來西亞、日本等也有分布。雞屎藤作為傳統(tǒng)的中草藥，除了具有消食祛風(fēng)濕、活血消腫的作用之外，還具有清熱、解毒、補(bǔ)血和治療腹瀉痢疾、外傷性疼痛、黃疸型肝炎、腸炎、肺結(jié)核咯血、支氣管炎等功效，現(xiàn)如今常用它的根、莖、葉、果實(shí)的提取物來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙痛、胸痛，也可用來作為催吐藥和利尿劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究還證明，雞屎藤具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜的作用，對(duì)痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌有抑制作用，尚有治療多發(fā)性骨髓瘤、肝癌的作用。此外，雞屎藤莖上的皮還是造紙及人造棉的重要原料。正是基于雞屎藤有著如此寶貴的藥用和食用價(jià)值，且自然條件下貴州省1年只能收1季，并且絕大多數(shù)是野生的，人工種植面積很小，導(dǎo)致產(chǎn)量非常有限，難以滿足市場(chǎng)的需求，加上經(jīng)過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)雞屎藤離體快繁的報(bào)道極少，尚未發(fā)現(xiàn)有人對(duì)雞屎藤的離體快繁培養(yǎng)基篩選有相關(guān)研究，這充分肯定了擬寫該篇論文的意義。為了更進(jìn)一步地開發(fā)雞屎藤，使雞屎藤一年四季能被人類大規(guī)模地種植和利用，給人類帶來福音，更為了深入開發(fā)利用貴州省中草藥資源和大力推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，擬寫該篇論文。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖雞屎藤，對(duì)雞屎藤的開發(fā)利用和野生資源保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，我特將對(duì)雞屎藤的離體快繁幾種培養(yǎng)基篩選結(jié)果報(bào)道如下：12 材料與方法 2.1 試驗(yàn)材料生長(zhǎng)健壯、幼嫩、無病蟲害的雞屎藤葉。本試驗(yàn)所用雞屎藤的葉采自貴州省凱里市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)凱里學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)樓后山八月瓜種植基地附近，2012年7月、8月、9月各采集一次，現(xiàn)采現(xiàn)用。 2.2 試驗(yàn)方法 2.2.1培養(yǎng)基的配置按照表1中的配方分別配制MS培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基各1升（除了表1 中的配方外，還需加入NAA0.5mg/L 、6-BA0.5mg/L、瓊脂8g/L）即MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+瓊脂8g/L，B+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+瓊脂8g/L，N6+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+瓊脂8g/L。配制過程中，要選用新鮮的蒸餾水。由于需要稱量的藥品較多，而且有些藥品稱量的量極少，為了減少麻煩，使接下來的試驗(yàn)過程更加方便快捷，可以把各種培養(yǎng)基的藥品的量擴(kuò)大10倍、100倍再稱量，分別配制3種培養(yǎng)基的母液（各種母液中都事先不要加入CaCl22H2O和激素，因?yàn)榧尤隒aCl22H2O后易產(chǎn)生沉淀，配制培養(yǎng)基時(shí)再加。除此之外，需加熱溶解的藥品一定要水浴加熱溶解，如FeSO47H2O、CaCl22H2O。配好的母液必須清澈透明才能使用）當(dāng)需要配制培養(yǎng)基時(shí)，取用適量的母液按已擴(kuò)大的倍數(shù)稀釋即可。 2.2.2滅菌將配制好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶中（30mL/瓶），每1種培養(yǎng)基得到33瓶。準(zhǔn)備1000mL大燒杯2個(gè)，500mL大燒杯3個(gè)，大培養(yǎng)皿2個(gè)，玻璃棒1根，槍形鑷2把，解剖刀1把，濾紙15張，1000mL用廣口瓶裝好的蒸餾水，分別用報(bào)紙和橡皮筋包扎好后，整齊規(guī)范地放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121oC、1.01Pa滅菌30min。2.2.3開啟無菌操作臺(tái)中的紫外滅菌燈在培養(yǎng)基滅菌的時(shí)候，用75%的酒精四處噴灑無菌操作臺(tái)的臺(tái)面并用酒精棉球擦拭1遍，之后將裝有75%酒精棉球的試劑瓶1個(gè)，裝有75%酒精的試劑瓶1個(gè)，裝有0.1%升汞的試劑瓶1個(gè)，酒精燈1盞，打火機(jī)1個(gè)，放入操作臺(tái)，把操作臺(tái)的門關(guān)上，打開紫外燈，并把風(fēng)速調(diào)到最大，滅菌20min。 2.2.4準(zhǔn)備試驗(yàn)材料將采集來的雞屎藤嫩葉用洗潔精輕輕的清洗1遍，用大量自來水沖洗數(shù)遍，瀝干水備用。 2.2.5接種穿上無菌服，用酒精噴灑雙手后將已滅好菌的培養(yǎng)基等物品在關(guān)閉紫外燈的情況下放入無菌操作臺(tái)，再打開紫外燈接著滅菌10min，之后關(guān)掉紫外燈，風(fēng)機(jī)依然開到最大，等培養(yǎng)基和無菌水冷卻后開始接種。用75%酒精噴灑完雙手后把已經(jīng)洗凈瀝干水的雞屎藤葉放入操作臺(tái)上的燒杯中，用75%的酒精消毒1030s，之后用無菌水沖洗5次后，用0.1%的升汞溶液消毒10min，之后用無菌水沖洗8次，瀝干水后放入墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在酒精燈旁把雞屎藤葉切成1mm2大小的方塊，用槍形鑷接種到培養(yǎng)瓶中，每瓶接種4片，每接種1次，槍形鑷在酒精燈上灼燒1次，接種要注意在酒精燈旁操作，且要將瓶蓋在酒精燈上繞2圈以便最大程度地滅菌。3種培養(yǎng)基上分別接種了120片雞屎藤外植體。 2.2.6初代培養(yǎng)把已經(jīng)接種好外植體的培養(yǎng)瓶放入恒溫箱中培養(yǎng)，第1周不需要光照，第2周開始白/夜光照12h，光照強(qiáng)度80 xl，溫度都為25oC。觀察并記錄結(jié)果。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)為86片，B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)為72片，N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)為2片，見表2。由此舍棄N6培養(yǎng)基的繼代。 2.2.7 繼代培養(yǎng)當(dāng)外植體長(zhǎng)出愈傷組織，即接種3周左右后，原本的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)差不多消耗完了，此時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方與初代培養(yǎng)的相同。誘導(dǎo)出的愈傷組織有大有小，所以在繼代的時(shí)候需按照它的大小來切割。MS培養(yǎng)基上的86片愈傷組織有20片切成6塊，23片切成5塊，29片切成4塊，14片切成3塊，20片切成2塊，每瓶繼代4塊，共繼代了108瓶。B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的72片愈傷組織，18片切成6塊，12片切成5塊，17片切成4塊，23片切成3塊，2片切成2塊，每瓶繼代4塊，共繼代了77瓶。只要未被污染的培養(yǎng)物都長(zhǎng)勢(shì)良好，見表3。表1 MS培養(yǎng)基、B培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基配方成分用量（mg/L）MSB5N6大量元素NH4NO31650KNO3190025002830CaCl22H2O440150166MgSO47H2O370250185KH2PO4170 400(NH4)2SO4 134 463 NaH2PO4H2O150微量元素KI0.830.750.8H3BO36.23.01.6MnSO4H2O16.9103.3ZnSO47H2O8.62.01.5Na2MoO42H2O0.250.25CuSO45H2O0.0250.025CoCl26H2O0.0250.025Na2EDTA2H2O37.3 37.337.3FeSO47H2O27.8 27.827.8有機(jī)成分甘氨酸2.0 2.0鹽酸硫胺素0.4101.0鹽酸吡哆醇0.510.5煙酸0.510.5肌醇100100蔗糖30g20g50gPH5.75.55.8 2.3 試驗(yàn)觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 表2 初代培養(yǎng)觀察記錄表觀察天數(shù)（d）污染數(shù)（瓶）誘導(dǎo)數(shù)（片）MSB5N6MSB5N6第3天001000第4天000000第5天111000第6天110000第7天021000第8天100300第9天001421第10天101750第11天110530第12天010620第13天101740第14天001560第15天010831第16天011660第17天100860第18天001450第19天000840第20天000680圖 1 初代培養(yǎng)情況統(tǒng)計(jì)圖表3 繼代培養(yǎng)觀察記錄表觀察天數(shù)（d） 污染數(shù)（瓶） 成活數(shù)（個(gè)）MSB5MSB5第3天0164第4天2297第5天31109第6天11 1411第7天211315第8天101819第9天021515第10天311316第11天011415第12天201716第13天111312第14天22 1614第15天101911第16天111516第17天011413第18天001715第19天111512第20天001613第21天001011圖2 繼代培養(yǎng)情況統(tǒng)計(jì)圖以上試驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)記錄從接種第3天開始，每天觀察1次，記錄被污染的瓶數(shù)及誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)。表4 三種培養(yǎng)基接種外植體20d后記錄表培養(yǎng)基污染率（%）誘導(dǎo)率（%） 平均值 平均值MS培養(yǎng)基0.23000.08000.05000.12000.93000.92000.95000.9300B5培養(yǎng)基0.26000.12000.03000.14000.82000.8000.87000.8300N6培養(yǎng)基0.3000.04000.07000.14000.02000.01000.01000.0100 圖 3 三種培養(yǎng)基20d后的污染情況統(tǒng)計(jì)圖表5 二種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)物21d后記錄表培養(yǎng)基污染率（%）誘導(dǎo)率（%）平均值平均值MS培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基0.24000.21000.12000.11000.1000.09000.15000.14000.61000.79000.70000.82000.73000.85000.68000.8200圖4 二種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)物21d后記錄統(tǒng)計(jì)方法：污染率及誘導(dǎo)率的計(jì)算如下：污染率=污染瓶數(shù)/總瓶數(shù) 誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)的葉片數(shù)/總的葉片數(shù)3結(jié)果與分析3.1 MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織 上圖為MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織圖，可以清楚地看到MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基上的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，肉眼看去愈傷組織呈現(xiàn)嫩綠色、酥脆而且晶瑩剔透。而N6培養(yǎng)基上的外植體并沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。3.2初代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析組織培養(yǎng)對(duì)試驗(yàn)人員的技術(shù)和環(huán)境條件要求特別高，因此在整個(gè)組織培養(yǎng)過程中，要嚴(yán)格按照配方和要求來配制培養(yǎng)基，嚴(yán)格清洗外植體，嚴(yán)格按照程序接種外植體，特別是滅菌和接種非常關(guān)鍵，稍不注意就會(huì)造成嚴(yán)重的污染，導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。污染來源最多的地方就是接種，接種時(shí)要嚴(yán)格做好每一步消毒工作，進(jìn)入已消完毒的接種室前，要穿好已消過毒的實(shí)驗(yàn)服，操作時(shí)工作人員盡量不要講話，在操作規(guī)范的前提下速度要盡量快，以減少各種細(xì)菌的侵入。另外，之所以選擇雞屎藤的葉而不是莖或者嫩芽來完成試驗(yàn)，是因?yàn)樵谡阶鲈囼?yàn)之前，我試著用莖、嫩芽和葉來做對(duì)比，最后試驗(yàn)結(jié)果顯示，葉的效果比較明顯，所以本實(shí)驗(yàn)選用雞屎藤的葉來完成試驗(yàn)。 3.3 MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基上繼代的培養(yǎng)物上圖為MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的愈傷組織圖，由圖上可看出MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基上的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)都非常好。 3.4繼代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果與分析繼代培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果表明，只要是在未被污染的B5培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物都能長(zhǎng)出良好的愈傷組織，這些愈傷組織長(zhǎng)得比初代培養(yǎng)時(shí)更大，更綠，更晶瑩剔透。通過初代培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)，可以更容易從試驗(yàn)中得出正確的試驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)槌醮囵B(yǎng)時(shí)，受到切割的外植體需要一段自我修復(fù)的時(shí)間，所以初代培養(yǎng)時(shí)愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)緩慢，幾乎看不到多大的變化，直到培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)都快消耗殆盡了愈傷組織才長(zhǎng)了一丁點(diǎn)大，通過繼代培養(yǎng)后，雖然培養(yǎng)物也受到了切割，但是此時(shí)的培養(yǎng)物在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上有更強(qiáng)的生命力，加上培養(yǎng)基新鮮且營(yíng)養(yǎng)豐富，所以此時(shí)長(zhǎng)出的愈傷組織較初代培養(yǎng)時(shí)更好，這樣更有利于做出更準(zhǔn)確的判斷，從而得出更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。4結(jié)論 通過用MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基來誘導(dǎo)雞屎藤的葉產(chǎn)生愈傷組織的試驗(yàn)結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基最適合雞屎藤的離體快繁，MS培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的培養(yǎng)物最多、最好。B5培養(yǎng)基其次，N6培養(yǎng)基效果最不明顯。因此，對(duì)于雞屎藤的離體快繁，可選用MS培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)1中國(guó)科學(xué)院植物研究所編中國(guó)高等植物圖鑒M第四冊(cè)科學(xué)出版社，20022702吳修仁廣東藥用植物簡(jiǎn)編M廣東高等出版社，19894583余愛農(nóng)，龔發(fā)俊，劉定書鮮品揮發(fā)油化學(xué)成分的研究J湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)2003，21（1）4張書霞雞屎藤的營(yíng)養(yǎng)成分分析J；食品研究與開發(fā)；2006年03期5李任珠，邢振聰,邱海平海南中草藥材雞屎藤離體培養(yǎng)的研究J海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2000年03期6馬養(yǎng)民，毛遠(yuǎn)，傅建熙雞屎藤揮發(fā)油化學(xué)成分的研究J；西北植物學(xué)報(bào)，2000年01期7馬養(yǎng)民，毛遠(yuǎn)雞屎藤化學(xué)成