綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 畢 業(yè) 論 文題 目： 綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究 學 院： 食品科學與工程學院 姓 名： 王菁 學 號： 20134775 專 業(yè)： 食品質(zhì)量與安全 班 級： 食安1302班 指導教師： 楊麗聰 職 稱： 講師 二一七年五月目錄摘要IAbstractII前言11材料與方法21.1 材料與試劑21.2 儀器與設備22 試驗方法32.1 綠原酸納米硒的制備32.2 綠原酸納米硒的表征32.2.1 紫外分光光度法32.2.2 傅里葉紅外光譜分析法32.2.3 熒光光譜法32.3 綠原酸納米硒抗氧化能力測定42.3.1 還原力的測定42.3.2 清除羥自由基能力的測定42.3.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定42.3.4 清除ABTS+自由基能力的測定53 結(jié)果與分析53.1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析53.2 綠原酸納米硒的表征53.2.1 CGASeNPs的紫外光譜分析53.2.2 紅外光譜下的CGASeNPs63.2.3 綠原酸納米硒熒光光譜分析73.3 綠原酸納米硒抗氧化能力的測定73.3.1 綠原酸納米硒還原力的測定73.3.2 綠原酸納米硒清除羥自由基的能力83.3.3 綠原酸納米硒清除超氧陰離子的能力93.3.4 綠原酸納米硒清除ABTS+自由基的能力94 結(jié)論10參考文獻11致謝12綠原酸納米硒的制備及其抗氧化性的研究摘要綠原酸具有較好抗氧化，但其水溶性及穩(wěn)定性較差。為了解決這一問題，本試驗采用綠原酸直接還原制備綠原酸納米硒（CGASeNPs）。選用熒光光譜法、紫外分光光譜法及傅里葉紅外光譜法對所制得的CGASeNPs進行表征。并進一步通過對CGASeNPs對羥自由基、超氧陰離子、ABTS+清除能力及還原力測定，評估CGASeNPs抗氧化能力。結(jié)果顯示，與CGA相比，CGASeNPs的紫外吸收峰，及傅里葉紅外光譜當中的-OH特征峰均出現(xiàn)位移，說明已成功制備CGASeNPs。熒光光譜顯示所制備的CGASeNPs具有熒光性?？寡趸囼烇@示CGASeNPs清除自由基及還原力均優(yōu)于陽性對照組VC及CGA。本試驗結(jié)果表明CGASeNPs是一種高效的、穩(wěn)定且?guī)в袩晒馓匦缘男滦涂寡趸牧?，這為納米材料做為抗氧化劑的應用提供一定的理論依據(jù)。關鍵詞：綠原酸；納米硒；制備；抗氧化AbstractChlorogenic acid has good oxidation resistance, but its water solubility and stability is poor. In order to solve this problem, chlorogenic acid nano selenium (CGASeNPs) was prepared by direct reduction of chlorogenic acid. The prepared CGASeNPs were characterized by fluorescence spectroscopy, ultraviolet spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy. The antioxidant capacity of CGASeNPs was further evaluated by the determination of hydroxyl radical, superoxide anion, ABTS+ scavenging ability and reducing power of CGASeNPs. The results showed that the UV absorption peaks of CGASeNPs and the -OH in Fourier transform infrared spectroscopy show that CGASeNPs have been successfully prepared compared with CGA. Fluorescence spectra showed that the prepared CGASeNPs were fluorescent. Antioxidant experiments showed that CGASeNPs scavenging free radicals and reducing power were better than those of positive control group Vc and CGA. The experimental results showed that CGASeNPs are antioxidant materials with efficient, stable and fluorescent properties, which provides a theoretical basis for the application of nanomaterials as antioxidants.Key words: chlorogenic acid; selenium nanoparticles; preparation; antioxidantII前言綠原酸（chlorogenic acid， CGA）分子式：C16H18O9，又稱咖啡鞣酸，是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，具有較多的生物活性，如抗病毒、抗菌、降血壓等 1。由于它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護組織免受氧化作用的損害2。然而，綠原酸本身不穩(wěn)定，難溶于水，易溶于乙醇及丙酮等極性有機溶劑，且它的分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如下圖所示。這也導致了綠原酸的生物利用度低、穩(wěn)定性差。因此，綠原酸在人體中的使用受到很大程度的限制。納米科學技術的到來，給人類認識自然和改造自然開辟了新的窗口。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1-100nm)，或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料具有量子尺寸效應、表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應3，因此在光學、電學、熱學、磁學等多方面表現(xiàn)出大塊材料所不能比擬的優(yōu)越性，在分析檢測、生物傳感、藥物傳遞、生物醫(yī)學等眾多領域都有廣泛的應用。因此，研究如何利用納米材料實現(xiàn)對綠原酸的負載和傳遞，促進綠原酸發(fā)揮藥效，具有十分重要的意義。硒是動物體必不可少的微量元素之一，化學符號是Se，一種非金屬。硒有提高免疫力、預防癌癥、抗氧化、拮抗有害重金屬、調(diào)節(jié)維生素吸收與利用等作用4。但是硒的營養(yǎng)劑量和可耐受的最高攝入量之間的范圍很窄，容易引起硒中毒5。納米硒不僅有很高的生物利用率和生物活性，而且毒性很低，是目前被發(fā)現(xiàn)的毒性最低的硒形式5。本試驗運用納米技術將不穩(wěn)定的利用價值高的綠原酸修飾在低毒、高生物活性的納米硒上，既可以克服綠原酸不穩(wěn)定的缺點，又能克服無機硒和有機硒毒性大這一缺點。隨后用熒光光譜法、紫外分光光度法及傅里葉紅外光譜法對CGASeNPs進行表征，試驗結(jié)果說明我們獲得了穩(wěn)定的帶有熒光特性的CGA修飾的納米硒材料。由于綠原酸和硒均具有抗氧化的特點，我們對所制備的CGASeNPs的抗氧化性進行研究，確定我們所合成的CGASeNPs抗氧化能力與CGA對比有所提高，這說明綠原酸納米硒有望成為一種高效的、穩(wěn)定的新型抗氧化材料，為納米材料做為抗氧化劑的應用提供一定的理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與試劑亞硒酸鈉 山東西亞化學工業(yè)有限公司綠原酸（CGA，純度為98%） 上海源葉生物科技有限公司2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS+） 上海源葉生物科技有限公司維生素C 上海藍季科技發(fā)展有限公司 鄰苯三酚 天津市大茂化學試劑廠鹽酸 天津市大茂化學試劑廠磷酸二氫鈉 天津市大茂化學試劑廠無水乙醇 天津市大茂化學試劑廠雙氧水 天津市大茂化學試劑廠過硫酸鉀 天津市大茂化學試劑廠綠礬 天津永大化學試劑開發(fā)中心水楊酸 天津永大化學試劑開發(fā)中心磷酸氫二鈉 天津永大化學試劑開發(fā)中心Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化學試劑廠鐵氰化鉀 天津市福晨化學試劑廠三氯化鐵 西隴化工股份有限公司。1.2 儀器與設備超純水機 廈門精藝興業(yè)科技有限公司JD1000-2電子天平 沈陽龍騰電子有限公司GPX-9248干燥箱/培養(yǎng)箱（兩用） 上海躍進醫(yī)療器械有限公司HH-數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱 上海圣科儀器設備有限公司CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司UV-5200PC紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司970CRT熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司YP-2壓片機 上海山岳科學儀器有限公司IS5傅里葉紅外光譜儀 上海力晶科學儀器有限公司TGL-16GB臺式離心機 上海書培實驗設備有限公司TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠SB-3200DTDN超聲波清洗機 寧波新藝生物科技服份有限公司BDC-215KS電冰箱 青島海爾股份有限公司2 試驗方法2.1 綠原酸納米硒的制備有研究表明，CGA溶解在50%的乙醇中并在4下保存最穩(wěn)定7。因此，我們精密稱取一定量的純度為98%的CGA、亞硒酸鈉，將綠原酸溶于50%的乙醇中，亞硒酸鈉溶于超純水中，將配制的25 mM綠原酸與0.1 M亞硒酸鈉按一定的比例在450 r/min轉(zhuǎn)速及室溫下攪拌在一起直至溶液顏色由無色變?yōu)榇u紅色后停止攪拌，離心洗滌之后，重新溶解在50% 醇溶液中，4下過夜保存5-6。這種方法使得CGA修飾在納米硒材料上，制得均一穩(wěn)定的CGASeNPs溶液。2.2 綠原酸納米硒的表征2.2.1 紫外分光光度法 制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs，再用50% 乙醇溶解成樣液。采用紫外可見分光光度法在200-600 nm的波長范圍內(nèi)對樣液進行波譜掃描8，以50%乙醇做基準線校正液，將CGA醇溶液與CGASeNPs樣液的紫外光譜圖進行對比。2.2.2 傅里葉紅外光譜分析法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs。將所得沉淀的離心管用保鮮膜包裹后放入恒溫干燥箱內(nèi)進行干燥24h，用溴化鉀壓片后，用紅外光譜儀對其進行紅外分析。在400-4000 cm-1范圍內(nèi)分別對干燥后的CGASeNPs和CGA進行紅外波譜掃描，記錄其紅外光譜9。2.2.3 熒光光譜法配制后的CGASeNPs在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下進行離心，棄上清液，所得的沉淀即為CGASeNPs。再用50%乙醇溶解所得沉淀制成樣品溶液。以最大激發(fā)波長ex=350nm激發(fā), 在380-600 nm之間檢測最大發(fā)射波長em處的熒光強度值, 激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均設定為10 nm10-11。2.3 綠原酸納米硒抗氧化能力測定2.3.1 還原力的測定分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL樣品溶液于試管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL (pH = 6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，混勻后于50 恒溫水浴鍋中水浴加熱20 min后，快速冷卻，再加入1.0 mL 10% 三氯乙酸，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.1% 的三氯化鐵溶液0.25 mL，再加1.75 mL蒸餾水，充分混勻后，在700 nm處測定其吸光值Ai，空白對照以1.0 mL蒸餾水代替樣液測吸光度A013。以Vc及CGA為陽性對照，進行CGA、CGASeNPs與Vc的還原力大小對比。2.3.2 清除羥自由基能力的測定分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1.0 mL樣品溶液于試管中，依次加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵、1.0 mL 6 mmol/L雙氧水，混勻后靜置10 min，再加入1.0 mL 6 mmol/L水楊酸，混勻后靜置30 min，于510 nm處測吸光度Ai。以1.0 mL蒸餾水代替水楊酸測吸光度Aj，空白對照以1.0 mL蒸餾水代替樣液測吸光度A011-13。以Vc及CGA為陽性對照，計算羥自由基的清除率E：E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定此試驗是利用鄰苯三酚的自氧化反應測定CGA對其產(chǎn)生的超氧陰離子的清除作用，在堿性的條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應，生成有色物質(zhì)，我們通過加入樣品溶液阻止中間產(chǎn)物的積累，吸光度降低，以Vc作為陽性對照，研究所制得的CGASeNPs的清除超氧陰離子能力是否提高。取pH = 8.2，2.25mL，50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液于試管中，加入1.0 mL蒸餾水，于25水浴加熱20 min，再分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的CGASeNPs溶液1 mL于試管中，再加入25 mmol/L的鄰苯三酚0.25 mL混勻，在25水浴中反應6 min，立即滴加0.5 mL 10 mmol/L的鹽酸終止反應，在320 nm下測定吸光值Ai，以1.0 mL蒸餾水代替鄰苯三酚測吸光度Aj ，以1.0 mL蒸餾水代替CGASeNPs溶液測吸光度A011-14。以Vc及CGA為陽性對照，計算超氧陰離子自由基的清除率E。E =（A0-Ai+Aj）/ A02.3.4 清除ABTS+自由基能力的測定精密稱取4.00 mg ABTS+粉末，然后加入新鮮配制的1.0 mg/mL的過硫酸鉀溶液0.8 mL，密封后避光靜置反應16 h，定量轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，再加入3.2 mL蒸餾水，用無水乙醇定容，放置10 h后使用。分別取20 g/mL、40 g/mL、60 g/mL、80 g/mL、100 g/mL的0.25mL CGASeNPs溶液于試管中，用80乙醇補至1.0 mL，再加入1.0 mL ABTS+工作液，搖勻，避光反應6 min，在734 nm下測吸光值Ai,以80乙醇代替樣品溶液作為空白對照，測吸光度A015。以Vc及CGA為陽性對照，計算樣品溶液對ABTS+自由基清除率E。E = （A0-Ai）/ A03 結(jié)果與分析3.1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析圖1 綠原酸納米硒穩(wěn)定性分析圖制備后的CGASeNPs 4保存1到14天如圖1所示，圖中左邊均為CGA醇溶液，右邊是離心洗滌之后，重新分散在醇溶液中CGASeNPs溶液，我們可以看出CGASeNPs為均一穩(wěn)定的磚紅色溶膠狀，通過兩周的4冷藏保存，CGASeNPs溶膠狀態(tài)幾乎沒有變化，說明CGASeNPs的穩(wěn)定性良好。3.2 綠原酸納米硒的表征3.2.1 CGASeNPs的紫外光譜分析從CGA與CGASeNPs紫外光譜如圖2所示，CGA屬于酚類物質(zhì)，含有苯環(huán)、雙鍵、羰基等不飽和結(jié)構(gòu)，其329 nm 有紫外吸收峰8。制備出的CGASeNPs的吸收峰有些微的偏移，CGASeNPs的最高峰由CGA醇溶液337 nm移至334 nm處，藍移了3nm。CGA修飾在納米硒上使得吸收峰的位置發(fā)生一定的偏移，說明所制得的納米硒表面修飾劑為綠原酸。圖2 CGA與CGASeNPs紫外光譜圖3.2.2 紅外光譜下的CGASeNPsCGA具有酚羥基、苯環(huán)、羰基的特征吸收峰。從CGAs與CGASeNPs紅外光譜如圖3所示，CGA的羥基的峰在3353.99 cm-1處，制成的CGASeNPs的羥基的峰移至3419.00 cm-1處，合成后羥基的峰發(fā)生了紅移，說明羥基參與了合成，CGA修飾到了納米硒表面。圖3 CGA與CGASeNPs紅外光譜圖3.2.3 綠原酸納米硒熒光光譜分析從CGA與CGASeNPs的熒光光譜如圖4所示，CGASeNPs的激發(fā)峰由CGA醇溶液的442.9 nm移至437.5 nm處，藍移了5.4 nm。證明CGA被修飾到了納米硒表面，制得了帶有熒光特性的納米硒材料。圖4 CGA與CGASeNPs的熒光光譜圖3.3 綠原酸納米硒抗氧化能力的測定3.3.1 綠原酸納米硒還原力的測定根據(jù)CGASeNPs、CGA與Vc的還原力如圖5所示，還原力測試CGASeNPs、CGA和Vc的吸光值都隨著濃度的增加而增大，說明在0 g/mL-100 g/mL，隨著樣品溶液濃度增加，其還原能力不斷增強，并有良好的線性關系，在100 g/mL處的還原力CGASeNPs為1.304，Vc為0.704，CGA為0.468。CGASeNPs的還原力最強，其次是Vc，最后是CGA。說明將綠原酸修飾在納米硒上之后，其還原能力得到了提高。圖5 CGASeNPs、CGA和Vc還原力圖3.3.2 綠原酸納米硒清除羥自由基的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除羥自由基能力如圖6所示，在0 g/mL-100 g/mL，隨著樣品溶液濃度增加，CGASeNPs清除羥自由基的能力不斷增強，在100 g/mL處羥自由基的清除率CGASeNPs為71.0%，CGA為67.0%，Vc為65.9%。CGASeNPs的還原力最強，其次是CGA，最后是Vc。說明制備的CGASeNPs的羥自由基的清除能力得到了提高。圖6 CGASeNPs、CGA和Vc清除羥自由基能力圖3.3.3 綠原酸納米硒清除超氧陰離子的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除超氧陰離子能力如圖7所示，CGASeNPs清除超氧陰離子的能力最強，其次是Vc，最后是CGA。但是CGASeNPs在40 g/mL后的趨勢逐漸平緩，Vc在60 g/mL后趨于平緩，并在80-100 g/mL時幾乎相等，在100 g/mL處超氧陰離子自由基的清除率CGASeNPs為98.5%，Vc為98.0%，CGA為79.9%。說明通過將CGA修飾在納米硒表面的手段提高了CGA清除超氧陰離子的能力，但是到達一定的濃度后其清除率不會再增加了。圖7 CGASeNPs、CGA和Vc清除超氧陰離子能力圖3.3.4 綠原酸納米硒清除ABTS+自由基的能力CGASeNPs、CGA與Vc清除ABTS+能力如圖8所示，表明所有樣品對ABTS+自由基的清除能力都隨濃度的增加而增強，其中CGASeNPs清除ABTS+自由基能力最強，其次是Vc，最后是CGA，但是綠原酸納米硒在60 g/mL后的趨勢逐漸平緩，Vc在80 g/mL后趨于平緩，在100 g/mL處ABTS+自由基的清除率CGASeNPs為96.0%，CGA為66.6%，Vc為96.0%。說明將CGA修飾在納米硒上之后，其清除ABTS+自由基能力得到了提高,雖然能力逐漸增加，但是到達一定濃度后趨勢逐漸平緩。圖8 CGASeNPs、CGA和Vc清除ABTS+自由基能力圖4 結(jié)論通過制備出的CGASeNPs樣品溶液顏色的變化觀察以及運用紫外分光光度法、傅里葉紅外光譜法與熒光光譜法對CGASeNPs進行表征，各個特征峰的偏移說明我們成功的制備出了CGASeNPs。CGA修飾在納米硒的表面，使得所制備的CGASeNPs在水中具有良好的穩(wěn)定的分散體系?？寡趸缘脑囼灡砻鰿GA修飾后的納米硒對于清除羥自由基、超氧陰離子、ABTS+的能力以及還原力都有顯著的提高，CGASeNPs具有良好的抗氧化效果。這種方法的操作過程簡便、所選用的試劑無毒、反應條件溫和，所制備的 CGA修飾納米硒作為新型抗氧化劑具有良好的應用前景。11參考文獻1 徐賢柱，魏允，饒華，等. 綠原酸納米脂質(zhì)體制備與抑菌性分析J. 食品科學，2014，34(20)：62-66.2 李健民，徐艷明，朱魁元，等. 杜仲抗氧化生物活性研究進展J. 中醫(yī)藥學報，2010，38(02)：137-139.3 丁靜. 碳納米管和納米金顆粒用于DNA和小分子檢測的研究D. 湖南大學，2011. 4 Brooks J D， Metter E J， Chan D W， et al. 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