單核增生李斯特氏菌檢測.ppt

單核增生李斯特氏菌 檢測概述,內 容,簡介李斯特氏菌屬 單核增生李斯特氏菌生物學特性 流行病學 致病性 實驗室危害及其預防 檢測程序 快速檢測方法,李斯特氏菌屬,李斯特氏菌屬（Listeria ）普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學研究表明，其分為六個種： 單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 綿羊（伊氏）李斯特氏菌（Listeria ivanovii） 英諾克（無害）李斯特氏菌（Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（Listeria grayi） 在李斯特氏菌屬的六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥（listeriosis）相關。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。,生物學特性 -菌體形態(tài)及染色特征,革蘭氏陽性； 小的、類似球形桿菌，0.40.50.52m，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個、成短鏈、細胞彼此連成V形，或成群的細胞沿長軸方向平行排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀； 20-25周生鞭毛運動，在37只有較少的鞭毛或1根鞭毛； 無芽孢、無莢膜。,生物學特性-培養(yǎng)特性,兼性厭氧； 在20-25培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。 生長溫度范圍為2-42（也有報道在0能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為30-37。 pH范圍pH4.4-pH9.6。,生物學特性-培養(yǎng)特性,在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產生窄小的-溶血環(huán)。 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。,生物學特性-生化反應,氧化酶陰性。 能發(fā)酵多種糖類，產酸不產氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。 不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。,生物學特性-血清型,根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”。 致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。,生物學特性-抵抗力,該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長期存活； 對堿和鹽抵抗力強，60-70經5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min 可殺死此菌； 濕熱滅菌（121，至少15min）和干熱滅菌（160-170，至少1hr）可殺滅該菌，對紫外線和射線敏感； 該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素（已產生抗性）、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。,流行病學,分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進行傳播 寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲,流行病學,據(jù)報道，有1-10%的人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%的水產品、5-10%的奶及其產品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。 相關食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是軟奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、發(fā)酵過的生肉制作的香腸、生的和加工過的禽肉、各種生的肉類、生的和煙熏的魚肉。約有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。,致病性及其治療,該病的臨床表現(xiàn)，健康成人個體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。 由該菌造成的腦膜炎的致死率可高達70%，敗血癥的死亡率達50%，圍產期或新生兒感染的死亡率超過80%，懷孕期婦女的感染，母親通常能存活下來。 抗生素治療，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。,感染人群,感染劑量未知，但與該菌的毒力和易感人群的年齡、免疫狀態(tài)有關。 易感者： 孕婦/胎兒圍產期和新生兒的感染； 免疫缺損者； 癌癥病人 尤其是白血病的患者； 年紀較大的人； 沒有免疫缺陷的健康的人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌的食品后，也有患病的危險。,致病機理,單增李氏菌的抗原結構與毒力無關，它的致病性與毒力機理如下： 1、寄生物介導的細胞內增生，使它附著及進入腸細胞與巨噬細胞； 2、抗活化的巨噬細胞，單增李氏菌有細菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細胞內的過氧物（為殺菌的毒性游離基團）分解； 3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，有和兩種，為毒力因子。,實驗室危害,不是一種普遍的與實驗室相關的傳染病，目前只有少數(shù)有報道的案例發(fā)生； 直接攝取是最普遍的一種感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度的氣溶膠中，也可通過眼睛和破損的皮膚、粘膜進入體內造成感染。,注意事項,生物安全2級，操作時應有相應的防污染設施，在進行可能產生氣溶膠的操作時，應在生物安全柜內完成； 在直接接觸有感染性的材料時，必須穿著實驗服，戴手套和護目鏡； 懷孕的婦女應避免接觸傳染物。,操作要求,濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，加入1%次氯酸鈉溶液，由周邊向中心加，在清理之前要留充足的接觸時間（30min）； 廢棄：在廢棄前應先采取凈化措施，高壓蒸汽滅菌、化學消毒、焚燒等； 儲存：在有適當標記的密封容器內儲存。,25g樣品+225ml FB1增菌液,30 25h1h,1mL轉種10mLFB2增菌液,30 25h1h,VIDAS 快速篩選,陰性，報告結果,陽性，繼續(xù)鑒定,選擇性培養(yǎng)基（顯色培養(yǎng)基、OXA、PALCAM）,挑選可疑菌落，接種TSA-YE,35 24h,接種TSB-YE,藍色菌落檢驗,典型運動檢驗,過氧化氫酶試驗,革蘭氏染色,溶血試驗,動力試驗,協(xié)同溶血試驗,血清學試驗,報告結果,單核增生李斯特氏菌檢測流程（SN/T 0184.1-2005）,API鑒定試驗或生化試驗 尿素酶水解，硝酸鹽還原，葡萄糖，甘露醇，麥芽糖，鼠李糖，木糖，七葉苷，TSI MR-VP,檢測程序-增菌,目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、 Fraser肉湯（FB）、UVM（Modified University of Vermont broth，也叫UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buffered Listeria enrichment broth）,半量Fraser肉湯和Fraser肉湯,具有選擇性和區(qū)別性。 加入檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉靈，與培養(yǎng)基中的鐵離子反應，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。,UVM,UVM只有選擇性沒有區(qū)別性 加入萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉靈，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反應。,LEB和BLEB,只有選擇性沒有區(qū)別性 LEB是在TSB-YE的基礎上加入鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；加入的丙酮酸鈉，有助于受損細胞的恢復；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反應 BLEB是在LEB基礎上加入緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉,檢測程序-分離,分離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等。分離原理主要是基于李斯特氏菌具有D葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉靈，產生七葉苷，與鐵離子產生顏色反應而使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反應 還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagar listeria、RapidL. mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。,OXA平板 /(palcam),單核增生李斯特氏菌 ATCC 19117 48h，35培養(yǎng),OXA平板,無害李斯特氏菌ATCC 33090 48h，35培養(yǎng),顯色平板,檢測程序-鑒定,藍色菌落檢驗（Henry illumination） 典型運動：相差顯微鏡，輕微旋轉或翻跟頭 動力試驗：7天，傘形生長 過氧化氫酶試驗：陽性 革蘭氏染色：陽性短桿菌 溶血試驗：穿刺接種血平板 硝酸鹽還原試驗：5天，陰性 糖發(fā)酵試驗：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反應均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其他種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義,動力試驗,血平板,單核增生李斯特氏菌 ATCC 19117 36h，35培養(yǎng),血平板,無害李斯特氏菌 ATCC 33090 36h，35培養(yǎng),血平板,伊氏李斯特氏菌 ATCC 19119 24h，35培養(yǎng),協(xié)同溶血試驗,單核增生李斯特氏菌