細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝物生產(chǎn).ppt

第七章 細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝物的生產(chǎn),植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用主要包括以下3個(gè)方面: 1、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)； 2、植物體細(xì)胞無性系的快速繁殖和遺傳突變體的篩選； 3、植物細(xì)胞遺傳、生理、生化和病毒方面的基礎(chǔ)研究。 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的化合物很多，包括糖類、酚類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸以及帖類和生物堿等初生和次生代謝產(chǎn)物。,第一節(jié) 單細(xì)胞培養(yǎng) 一、單細(xì)胞的分離方法 (一)機(jī)械法: 分離葉肉細(xì)胞是首先輕輕研碎葉片組織,然后過濾和離心凈化細(xì)胞; 優(yōu)點(diǎn): 1 細(xì)胞不受酶的傷害; 2不需要質(zhì)壁分離;有利于進(jìn)行生理生化研究; 缺點(diǎn): 細(xì)胞結(jié)構(gòu)易受到傷害,獲得完整的細(xì)胞數(shù)量低; 雖然此法分離的細(xì)胞能分裂并形成愈傷組織,但仍不普遍適用;,(二)酶解法: 利用果膠酶，纖維素酶處理，分離出具有代謝活性的細(xì)胞。 不僅能降解中膠層，而且還能軟化細(xì)胞壁，但在分離獲得細(xì)胞的過程中，必須對細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)。,（三 ）從愈傷組織分離單細(xì)胞 首先通過組織培養(yǎng)的方法,誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織。接著對愈傷組織反復(fù)繼代以增加愈傷組織的松散性。同時(shí)還要利用不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長速度,結(jié)構(gòu)可松可緊-愈傷組織分散成單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)。,將愈傷組織放在較高鹽分,高生長素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后移入液體培養(yǎng)基并經(jīng)過攪拌而分散為單細(xì)胞,也可加入一些果膠酶;但一般來說得到純一的單細(xì)胞依然很少。 操作步驟:形成愈傷組織選擇未分化和易散碎的愈傷組織-轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中-振蕩培養(yǎng)小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。,二、單細(xì)胞培養(yǎng)方法 單細(xì)胞培養(yǎng)方法有三種：看護(hù)培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法、微室培養(yǎng)法。 (一)看護(hù)培養(yǎng)-把單個(gè)細(xì)胞置于一塊活躍生長的愈傷組織(看護(hù)組織)上培養(yǎng),在愈傷組織與培養(yǎng)細(xì)胞間用一層濾紙相隔;看護(hù)愈傷組織的作用不僅給培養(yǎng)細(xì)胞提供營養(yǎng)成分，還提供能促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)，細(xì)胞分裂物質(zhì)可通過濾紙而擴(kuò)散。,應(yīng)用看護(hù)培養(yǎng)法建立單細(xì)胞無性系,(二)平板培養(yǎng) 將含有游離細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物過濾，除去組織塊和大細(xì)胞團(tuán)，將液體培養(yǎng)基加入0.61%的瓊脂，融化，冷卻到35C，再將培養(yǎng)基與懸浮液等量混合，迅速注入并使之鋪展在培養(yǎng)皿(1mm厚)。35C溫度下,培養(yǎng)基保持液體狀態(tài)，也不會(huì)殺死細(xì)胞。封口,25C溫度,黑暗中培養(yǎng)?？梢远ㄆ阽R檢觀察細(xì)胞的生長情況。,用平板培養(yǎng)技術(shù)獲得單細(xì)胞無性系的程序,(三)微室培養(yǎng)法 由懸浮培養(yǎng)物中取出一滴含單細(xì)胞的培養(yǎng)液,置于一張無菌載玻片上的微室中進(jìn)行培養(yǎng),可以對細(xì)胞培養(yǎng)過程連續(xù)進(jìn)行顯微觀察,了解細(xì)胞經(jīng)過生長,分裂,分化,形成細(xì)胞團(tuán)的全部過程。,微室培養(yǎng)法示意圖,三、 影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子 初始細(xì)胞密度（1）是影響單細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因子。單細(xì)胞培養(yǎng)接種密度必須達(dá)到臨界細(xì)胞密度(103個(gè)細(xì)胞毫升以上，一般細(xì)胞密度在104105個(gè)細(xì)胞毫升）為宜，細(xì)胞密度過低，不利于細(xì)胞的增殖，而細(xì)胞密度過高形成的細(xì)胞團(tuán)混雜在一起，難于獲得單細(xì)胞系。,培養(yǎng)基的成分（2）是影響單細(xì)胞培養(yǎng)的又一關(guān)鍵因子。初始細(xì)胞密度的減小，細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求就越高，在培養(yǎng)基中添加如椰子汁、水解酪蛋白或酵母浸出液等，則可有效地取代影響細(xì)胞分裂的高密度細(xì)胞的群體效應(yīng)。在培養(yǎng)低密度植板假挪威械細(xì)胞時(shí)，必須在基本培養(yǎng)基中加入一種細(xì)胞分裂素、赤霉酸和幾種氨基酸，而這些添加物并不是該種植物愈傷組織培養(yǎng)所必須的。,第二節(jié) 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指將游離的單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)（含少數(shù)細(xì)胞的分生細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞聚集體）以一定的細(xì)胞密度接種到液體培養(yǎng)基中于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。用于培養(yǎng)的細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)來自愈傷組織，或某個(gè)器官或組織，通過物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得。,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是一種有用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系。一方面細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適應(yīng)于大規(guī)模培養(yǎng)，另一方面懸浮培養(yǎng)能夠得到大量的均勻的細(xì)胞，可以用來分離原生質(zhì)、篩選突變體、人工種子生產(chǎn)、生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)以及進(jìn)行植物細(xì)胞代謝生理、生化特征等方面的研究，為深入研究細(xì)胞的生長、分化提供良好的條件。,一、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的方法 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可分為分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 1.分批培養(yǎng) 是指將一定量的初始培養(yǎng)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)分散在一定量的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。在培養(yǎng)過程中,除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以與外界空氣交換外,一切都是密閉的。 所用容器一般為100250ml三角瓶,每瓶2075ml培養(yǎng)基; 為了使分批培養(yǎng)的細(xì)胞不斷增殖,必須進(jìn)行繼代培養(yǎng):取出培養(yǎng)瓶中一小部分(1/51/3)的懸浮液,轉(zhuǎn)移到含相同成分的新鮮培養(yǎng)基中;,分批培養(yǎng)是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中常用的方法，培養(yǎng)體系容易建立，重復(fù)性好，常常用于突變體篩選和遺傳轉(zhuǎn)化體系建立等方面的研究。,2. 連續(xù)培養(yǎng) 利用特別的培養(yǎng)容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方式;在連續(xù)培養(yǎng)的過程中,不斷注入新鮮培養(yǎng)基,排出等體積的用過的培養(yǎng)基,培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)的到不斷的補(bǔ)充,可調(diào)節(jié)注入與流出速度,故培養(yǎng)的細(xì)胞生長速率相對一致,形成一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)的培養(yǎng)。有封閉式和開放式2種。開放式連續(xù)培養(yǎng)又可分為化學(xué)恒定式和濁度恒定式。,連續(xù)培養(yǎng)是植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的一項(xiàng)重要技術(shù)，由于連續(xù)培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長的因子如培養(yǎng)溫度、通氣、攪拌速度、陽光、養(yǎng)分以及生長調(diào)節(jié)劑都可以調(diào)節(jié)和控制，因此連續(xù)培養(yǎng)不僅可用于植物次生產(chǎn)物的規(guī)模生產(chǎn)，也可用于對于植物細(xì)胞生長和代謝調(diào)節(jié)的研究。,二、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立 成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件: 1、懸浮培養(yǎng)物分散性良好;細(xì)胞團(tuán)較小。 2、均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。 3、生長迅速，細(xì)胞分裂旺盛一般在2-3d其生長量就能增加一倍 。,1. 疏松愈傷組織的誘導(dǎo) 不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長速度,結(jié)構(gòu)可松可緊,利用這些特性可使之分散成為單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)。誘導(dǎo)出松散易碎的愈傷組織對后來建立懸浮細(xì)胞系可以起到事半功倍的效果。 也可以通過多次的繼代篩選而獲得。 一般條件下,以幼胚誘導(dǎo)愈傷組織為最好;某些情況下直接用幼胚,下胚軸,子葉等作為外植體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)也比較容易建立懸浮細(xì)胞系。,一般用顆粒細(xì)小、松散易碎、外觀濕潤、鮮艷的白色或淡黃色的愈傷組織比較松散易碎、經(jīng)過幾次篩選、繼代至穩(wěn)定后、可以用于懸浮細(xì)胞系; 基本培養(yǎng)基：N6, MS B5 激素：2,4-D 2mgL-1, 附加6-BA,NAA 0.5mgL-1, 附加有機(jī)物：水解酪蛋白,L-脯氨酸,谷氨酰胺等; 培養(yǎng)基中蔗糖濃度較低(1030gL-1),有利于形成松散的愈傷組織，蔗糖濃度較高有利于形成堅(jiān)硬的愈傷組織和胚狀體。,通常情況下,松散易碎的愈傷組織不能直接由外植體誘導(dǎo)獲得,而是在愈傷組織在繼代過程中通過篩選獲得的。 懸浮培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可以使用愈傷組織培養(yǎng)基,但遇到懸浮細(xì)胞變褐,生長緩慢或停止時(shí),要重新選擇培養(yǎng)基，一般是: N6,MS,B5適合單子葉植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。 MS,B5,LS,SL等適合雙子葉植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中需要加入水解酪蛋白,椰乳,脯氨酸等,并注意及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,一般以間隔35天為適宜;培養(yǎng)基要求過濾除菌; 操作:2g松散易碎愈傷組織-2040ml液體培養(yǎng)基-搖床(120r/min,25C,黑暗或弱光),2. 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)程序 取2g新鮮疏松易碎的愈傷組織作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的初始材料，接入盛有2040 毫升液體培養(yǎng)基的100毫升三角瓶中，于轉(zhuǎn)速120 r/分鐘，溫度25C1C，黑暗或弱光條件下培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的接種量，以120 r/分鐘條件下細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)可在培養(yǎng)液中浮起為宜。,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與植株再生過程示意圖,3. 懸浮細(xì)胞的繼代與選擇 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)初期，可以看到原來許多較小的細(xì)胞團(tuán)慢慢變大，同時(shí)又產(chǎn)生一些新的小細(xì)胞團(tuán)。為了得到較均一的分散性好的懸浮細(xì)胞系，需要在每次繼代時(shí)，都去掉培養(yǎng)液中大的愈傷組織塊和細(xì)胞團(tuán)，保留單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，這樣反復(fù)繼代培養(yǎng)，直至得到均一的懸浮細(xì)胞系為止。,懸浮細(xì)胞的繼代與選擇方法: 方法1-將培養(yǎng)物搖勻，靜止片刻，用吸管吸取培養(yǎng)基中部的培養(yǎng)物。 方法2-通過過濾收集到小細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。 另外，在更換培養(yǎng)基時(shí)，棄去底部的愈傷組織塊和大細(xì)胞團(tuán)，只保留小細(xì)胞團(tuán)在瓶內(nèi)，加入新鮮培養(yǎng)基。,4. 懸浮細(xì)胞的同步化 經(jīng)過多次繼代和篩選得到的懸浮細(xì)胞系均一性是相對的，需要進(jìn)一步同步化培養(yǎng)，同步培養(yǎng)是指在培養(yǎng)體系中大多數(shù)細(xì)胞都能同時(shí)通過細(xì)胞周期的各個(gè)階段。 衡量細(xì)胞同步化的參數(shù)： 在某一時(shí)刻處于細(xì)胞周期某一點(diǎn)上的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；在一個(gè)短暫的具體時(shí)間內(nèi)通過細(xì)胞周期中某一點(diǎn)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；全部細(xì)胞通過細(xì)胞周期中某一點(diǎn)所需的總時(shí)間占細(xì)胞周期時(shí)間長度的百分?jǐn)?shù)。,實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法可分為物理方法和化學(xué)方法兩種。物理方法主要是通過對細(xì)胞物理特性（細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的大?。┗蛏L環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制以實(shí)現(xiàn)高度同步化，物理方法包括體積選擇法和低溫休克法。,化學(xué)方法是使細(xì)胞遭受某種營養(yǎng)饑餓，或是通過加人某種生長抑制劑阻斷細(xì)胞分裂周期而停留于某一分裂相，從而達(dá)到細(xì)胞同步化的方法。 （1） 饑餓法 饑餓法的原理是除去細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂和生長所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在細(xì)胞的分裂間期（G1期或G0期），經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓之后，重新補(bǔ)給除去的必須生長物質(zhì)，誘導(dǎo)恢復(fù)靜止細(xì)胞的同步分裂和生長。,（2）抑制法 通過使用DNA合成抑制劑如 5一氨基尿嘧啶、氟脫氧尿核苷（FUdR）、羥基脲和胸腺嘧啶脫氧核苷等使培養(yǎng)細(xì)胞同步化。細(xì)胞受到這些抑制劑處理后，細(xì)胞周期被阻斷在G1期，細(xì)胞都滯留在G1期和S期。去掉抑制劑后，細(xì)胞即進(jìn)人同步分裂和生長。,5. 影響細(xì)胞懸浮的因素 （1） 培養(yǎng)材料 1、用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體類型和基因型以及用于懸浮培養(yǎng)的初始愈傷組織材料均對細(xì)胞懸浮體系的建立均有較大影響。2、外植體的類型及生理狀況對愈傷組織的誘導(dǎo)十分關(guān)鍵。植物常用的外植體幼幼胚、成熟胚、下胚軸、子葉、葉片、幼穗和花藥等。,（2）培養(yǎng)基的影響 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基組成、溶氧以及添加物等對細(xì)胞分裂和生長具有十分重要的作用。不同種類植物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求是不同的，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，對基本培養(yǎng)基的要求也有差異。培養(yǎng)基中的碳源、氮源、一些微量元素以及一些有機(jī)物質(zhì)不僅影響細(xì)胞正常分裂和生長以，而且很多影響到細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的形成。,1、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所用基本培養(yǎng)基中大量元素的濃度對懸浮培養(yǎng)細(xì)胞存活率有較大影響。 2、低濃度的總氮有利于細(xì)胞的分裂，而高濃度的總氮?jiǎng)t有利于細(xì)胞的生長。銨離子被用于合成谷酰胺，硝態(tài)氮誘導(dǎo)代謝途徑中的多種酶基因的表達(dá)。 3、蔗糖是植物組織細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的碳源和能源，研究表明，一定濃度的蔗糖不僅能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的生長，還能夠刺激次生物質(zhì)的合成。,4、溶氧有一定的極限，過高或過低都會(huì)影響到細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成，特別是在高密度培養(yǎng)時(shí)，供氧不足往往可能是限制產(chǎn)量的主要因素之一。 5、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對懸浮細(xì)胞生長有較大的影響，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，不同種類的激素對細(xì)胞的分裂和生長的作用不同。如生長素類，2，4-D有助于薄壁細(xì)胞的生長，因此，懸浮培養(yǎng)中，常適量加入2，4-D。,（3）培養(yǎng)條件的影響 植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件對細(xì)胞的生長以及目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的合成具有很大的影響。溫度、光照、電磁場及電磁輻射以及超聲波等對于植物細(xì)胞培養(yǎng)都有很大的影響。在一定的溫度條件下，培養(yǎng)的植物細(xì)胞才能正常生長、增殖和維持正常的新陳代謝，植物細(xì)胞生長的最適溫度一般為25，不同的植物種類略有差異。,第三節(jié) 植物細(xì)胞的規(guī)模培養(yǎng) 利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)為植物有用代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)提供了有效途徑和生產(chǎn)方法。主要集中在制藥工業(yè)中一些價(jià)格高、產(chǎn)量低、需求量大的化合物上如紫杉醇、長春堿、青蒿素等 。植物大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、香料等領(lǐng)域廣泛用于生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品。人類迄今通過植物細(xì)胞培養(yǎng)獲得的生物堿、維生素、色素、抗生素以及抗腫瘤藥物不下50多個(gè)大類。,一、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法 植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)是大規(guī)模生產(chǎn)次生化合物的最有效的方法，其目的在于利用生物反應(yīng)器為次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)獲得大量遺傳穩(wěn)定、同步分裂、增殖迅速并且能大量積累次生代謝產(chǎn)物的細(xì)胞，生物反應(yīng)器是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)所用的為細(xì)胞生長和代謝提供適宜場所和環(huán)境的裝置。,1植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng) 大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的原理與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基本一致。用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有機(jī)械攪拌式反應(yīng)器和非攪拌式反應(yīng)器（又稱氣動(dòng)式反應(yīng)器）兩大類。根據(jù)所用生物反應(yīng)器的不同，將植物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)分為機(jī)械攪拌式植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)和氣動(dòng)式植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)。,（1） 機(jī)械攪拌式植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng) 機(jī)械攪拌式植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)是利用攪拌式反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)。攪拌式生物反應(yīng)器常常用于微生物發(fā)酵，該反應(yīng)器用于植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可借鑒微生物培養(yǎng)的成功經(jīng)驗(yàn)對植物細(xì)胞培養(yǎng)過程進(jìn)行控制。,機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器只能用于對剪切力耐受能力較強(qiáng)的植物細(xì)胞系,（2）氣動(dòng)式植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng) 針對利用機(jī)械攪拌式反應(yīng)器進(jìn)行植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中剪切作用大突出問題，研究者研制了利用氣流和氣泡進(jìn)行攪拌的氣動(dòng)式反應(yīng)器，也稱非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器。根據(jù)進(jìn)入反應(yīng)器的無菌空氣的方式不同，氣動(dòng)式反應(yīng)器又可分為氣升式反應(yīng)器和鼓泡式反應(yīng)器。,利用懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 有利于培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和氣體充分接觸； 培養(yǎng)體系中的溫度、PH值、養(yǎng)分濃度等培養(yǎng)條件易于控制； 適于在連續(xù)密閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，減少了污染的概率。缺點(diǎn)是大的剪切力對植物細(xì)胞具有傷害作用。,2 固定化細(xì)胞培養(yǎng) 固定化細(xì)胞培養(yǎng)是指通過物理或化學(xué)方法將培養(yǎng)細(xì)胞固定于限定的空間區(qū)域內(nèi)或表面，使之成為水不溶性，但細(xì)胞仍保持其生物活性的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。,固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)具有液體懸浮培養(yǎng)不具備的優(yōu)點(diǎn)： 固定化細(xì)胞間接觸緊密，生長緩慢，產(chǎn)生一定程度的分化，有利于次生代謝產(chǎn)物的積累； 細(xì)胞包埋在聚合物中，受到剪切力作用小，對培養(yǎng)細(xì)胞的損傷少； 固定化細(xì)胞容易回收，有利長期的連續(xù)培養(yǎng)； 培養(yǎng)條件易于控制，細(xì)胞穩(wěn)定性好。 非分泌性的次生代謝產(chǎn)物的釋放和固定化細(xì)胞內(nèi)的氧養(yǎng)分傳遞問題成為固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)主要障礙。,（1） 植物細(xì)胞的固定方法 植物細(xì)胞的固定方法可分為包埋式固定和吸附式固定兩大兩類。 包埋式固定：是將細(xì)胞包埋在多空在體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法，根據(jù)所用包埋載體的不同又分凝膠包埋法和半透明膜包埋法。 吸附式固定：是將細(xì)胞吸附在固體吸附劑表面而固定化細(xì)胞的方法。這種方法通常將細(xì)胞吸附在多孔陶瓷、多孔玻璃等材料的大孔隙或裂縫中，或吸附在中空纖維的外壁上。,（2） 固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 固定化細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器有流化床反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器和膜反應(yīng)器3類。 流化床反應(yīng)器利用培養(yǎng)液和無菌空氣流動(dòng)的能量將固定化植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法。其優(yōu)點(diǎn)是混合效果好；缺點(diǎn)是剪切力較大，放大培養(yǎng)困難。 膜反應(yīng)器是將植物細(xì)胞固定在具有一定孔徑和選擇透性的膜上，營養(yǎng)物質(zhì)通過膜滲透到細(xì)胞中，細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中的培養(yǎng)方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)膜設(shè)備中流體流動(dòng)與放大關(guān)系不大，減小了放大的困難；,填充床反應(yīng)器是將固定化植物細(xì)胞置于填充床反應(yīng)器中堆疊在一起，靜止不動(dòng)，通過培養(yǎng)基的流動(dòng)提供所需的養(yǎng)分和氧氣，同時(shí)帶出各種代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是單位體積的細(xì)胞密度大，細(xì)胞能緊密接觸，次生物質(zhì)產(chǎn)量較高；缺點(diǎn)是混合效果差、傳質(zhì)效率低，培養(yǎng)條件不易控制。,二、高產(chǎn)細(xì)胞系的建立與保存 實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的首要條件是獲得生長快、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)的高產(chǎn)細(xì)胞系。 1高產(chǎn)細(xì)胞系的建立 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選可以通過細(xì)胞表型差異和測定單細(xì)胞克隆的目的產(chǎn)物含量來進(jìn)行篩選，高產(chǎn)細(xì)胞系的建立需要經(jīng)過基因型選擇、外植體選擇、愈傷組織選擇、培養(yǎng)條件優(yōu)化、高產(chǎn)細(xì)胞系誘導(dǎo)與篩選等過程。 （1）基因型和外植體的選擇 次生代謝產(chǎn)物高的外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織，其生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的能力也高。,（2）愈傷組織選擇 同一外植體誘導(dǎo)得到的愈傷組織的性狀、質(zhì)地、生長能力以及代謝均有差異，最初幾代培養(yǎng)還可能發(fā)生體細(xì)胞無性系變異，合成次生代謝產(chǎn)物的能力并不穩(wěn)定，經(jīng)過多代的繼代培養(yǎng)，根據(jù)需要選擇目的產(chǎn)物的生產(chǎn)能力強(qiáng)的穩(wěn)定遺傳的愈傷組織細(xì)胞。,（3）高產(chǎn)細(xì)胞系誘導(dǎo) 利用化學(xué)或物理的方法誘導(dǎo)高產(chǎn)細(xì)胞系。物理誘導(dǎo)是采用X射線、y射線、射線、紫外線等輻射培養(yǎng)細(xì)胞，以獲得目的產(chǎn)物的高產(chǎn)細(xì)胞系；化學(xué)誘導(dǎo)是采用秋水仙素、對-氟苯丙氨酸（PFP）、5-甲基色氨酸和生物素等化學(xué)誘變劑來處理培養(yǎng)細(xì)胞得到目的產(chǎn)物的高產(chǎn)細(xì)胞系；也可以用環(huán)境脅迫作為選擇壓來誘導(dǎo)對環(huán)境脅迫具有抗性的細(xì)胞系。,（4）高產(chǎn)細(xì)胞系篩選 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選方法主要有： 目測法-從愈傷組織的形狀、顏色和質(zhì)地等外觀形態(tài)特征來初步判斷 ； 測定法-目的代謝產(chǎn)物含量 測定； 抗性篩選法-。,第四節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝及產(chǎn)物積累 一、植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的程序 目標(biāo)植物的選擇檢測 2高產(chǎn)目標(biāo)細(xì)胞系的選擇 3建立高產(chǎn)細(xì)胞系的培養(yǎng)體系 4細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng),二、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的方法 前體物飼喂及生物轉(zhuǎn)化 細(xì)胞固定體系 3兩相法培養(yǎng) 4應(yīng)用誘導(dǎo)子的生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物 5毛狀根和冠癭瘤的運(yùn)用 6生物轉(zhuǎn)化,第五節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞突變體篩選 體細(xì)胞無性系篩選具有以下優(yōu)點(diǎn)： 變異，增殖速度快，為目的突變體