WS214-2001流行性乙型腦炎診斷標準及處理原則.pdf

ws 2 1 4 -2 0 0 1前言 流行性乙型腦炎是由乙型腦炎病毒經(jīng)蚊蟲媒介而引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的急性傳染病， 是一種人畜共患的自 然疫源性疾病。 人感染乙型腦炎病毒后大多數(shù)表現(xiàn)為亞臨床型感染， 約1 輸( 或更少) 的感染者有典型的腦炎癥狀。我國是流行性乙型腦炎的流行區(qū)， 除西藏、 青海、 新孤等少數(shù)地區(qū)外， 全國都有發(fā)病報告。 河南、 湖南、 湖北、 貴州、 江西、 廣東、 廣西都是較重的流行地區(qū)。 目 前已有疫苗可供預防， 但無特異性有效的治療方法， 中華人民共和國傳染病防治法 中將流行性乙型腦炎列為乙類傳染病管理。 為更好地指導防治工作， 特制定本標準。 本標準的附錄A是標準的附錄。 本標準的附錄B是提示的附錄。 本標準由衛(wèi)生部疾病控制司提出。 本標準起草單位: 中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所、 北京地壇醫(yī)院。 本標準主要起草人: 張禮璧、 徐道振。 本標準由 衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部傳染病監(jiān)督管理辦公室負責解釋。中華 人 民共 和 國 衛(wèi) 生 行 業(yè) 標 準流行性乙型腦炎診斷標準及處理原則WS 2 1 4 2 0 0 1 D i a g n o s t i c c r i t e r i a a n d p r i n c i p l e s o fm a n a g e m e n t o f j a p a n e s e B e n c e p h a l i t i s1 范圍本標準規(guī)定了流行性乙型腦炎( 以下簡稱乙腦) 的診斷標準和處理原則。本標準適用于全國各級醫(yī)療、 保健機構(gòu)、 衛(wèi)生防疫機構(gòu)對流行性乙型腦炎的診斷、 報告和處理。2 診斷原則依流行病學史和癥狀體征、 實驗室檢查、 進行綜合分析、 作出臨床診斷， 確診須依靠血清學或病原學檢查 。3 診斷標準I1 流行病學 在乙腦流行地區(qū)居住， 在蚊蟲叮咬季節(jié)發(fā)病或發(fā)病前 2 5 d內(nèi)在蚊蟲叮咬季節(jié)到過乙腦流行地區(qū)旅行。3 . 2 癥狀體征12 . 1 急性起病， 發(fā)熱頭痛， 噴射性嘔吐， 嗜睡， 可伴有腦膜刺激癥狀3 . 2 . 2 急性起病， 發(fā)熱2 d -3 d 后出現(xiàn)不同程度的意識障礙， 如昏迷、 驚厥、 抽搐、 肢體痙攣性麻痹等中樞神經(jīng)癥狀， 或發(fā)展至中樞性呼吸循環(huán)衰蝎。3 . 2 . 3 腦脊液: 壓力增高， 呈非化膿性炎癥改變 外觀清亮， 蛋白輕度增高， 搪與氯化物正常， 自細胞增高， 多在( 5 0 - 5 0 0 ) X 1 0 fi / L ， 早期多核細胞為主， 后期單核細胞為主 。3 . 2 . 4 一個月內(nèi)未接種過乙腦疫苗者， 血或腦脊液中抗乙腦I g m抗體陽性。3 . 2 . 5 恢復期血清中抗乙腦I g G抗體或中和抗體滴度比急性期有 4 倍以上升高者， 或急性期抗乙腦I g G抗體陰性， 恢復期陽性者3 . 2 . 6 腦脊液、 腦組織、 血清分離乙腦病毒陽性( 詳見附錄A )3 . 3 病例分類3 . 11 疑似病例3 . 1 加3 . 2 . 1 或3 . 2 . 2 .13 . 2 臨床診斷病例疑似病例加3 . 2 . 33 . 3 . 3 確診病例臨床診斷病例加 3 . 2 . 4 或3 . 2 . 5 或3 . 2 . 6 04 處理原則4 . 1 治療 目前無特效抗病毒藥物， 主要以對癥1 支持、 綜合治療為主。4 . 1 . 1 乙腦病人室內(nèi)防蚊、 滅蚊， 精心護理和監(jiān)護病人， 密切觀察病情變化。中華人民共和國衛(wèi)生部 2 0 0 1 一 1 1 一 2 3 批準2 0 0 2 一 0 5 一 0 1實施ws 2 1 4 -2 0 0 14 . 1 . 2 對癥治療， 用物理和藥物控制體溫于3 8 左右， 抗驚厥、 抗抽搐、 抗腦水腫， 保持呼吸道通暢， 有呼吸衰竭時及早氣管切開， 必要時應用人工呼吸機。4 . 1 . 3 昏迷病人以鼻飼高熱量多維生素的營養(yǎng)性流食， 保持水和電解質(zhì)平衡。4 . 1 . 4 預防繼發(fā)感染， 早期發(fā)現(xiàn)感染早期治療。4 - 1 ， 5 恢復期有神經(jīng)肌肉的遺留癥狀者， 加強主動、 被動運動或針灸或物理康復治療。4 . 1 . 6 有條件者必要時可應用高壓氧艙治療。4 . 2 預防4 . 2 . 1 防蚊和滅蚊。4 . 2 . 2 乙型腦炎疫苗的預防注射。WS 2 1 4 -2 0 0 1 附錄A( 標準的附錄)實驗診斷方法A ， 病原學診斷 從病人的腦組織， 腦脊液或血液中查到流行性乙型腦炎病毒或抗原或特異性的核酸， 即可作出病原學診斷。A l . ， 病毒分離A l . 1 - 1 標本的收集 收集病毒血癥期的血液或發(fā)病早期的 腦脊液進行病毒分離， 但陽性率不高。 如取腦組織活檢材料或尸檢材料， 病毒分離的成功率較高， 但前者不易為病人所接受， 后期只能用于死后診斷。 其他組織如肝、脾、 腎、 淋巴結(jié)等很少被收集用于分離病毒。A l . 1 . 2 標本的處理 血液標本可無菌法用玻璃珠去纖維蛋白或加肝素等防凝后， 直接接種于敏感動物或雞胚， 或進行細胞培養(yǎng)， 腦脊液可以直接接種。 腦組織可加無菌1 0 %脫脂奶或生理鹽水， 研磨成勻漿， 經(jīng) 1 5 0 0 r f m i n3 0 m i n 離心沉淀， 取上清液接種動物或細胞。為防止細菌污染， 可于研磨勻漿過程中加人 1 0 0 0 UI ML的青霉素和1 0 0 0 p g l m L的鏈霉素。A l . 1 . 3 常用的敏感動物和雞胚 分離流行性乙型腦炎常用的敏感動物為三周齡的小白鼠或乳鼠( 1 -3日 齡) ， 每鼠腦內(nèi)接種標0 . 0 3 m L J 周鼠( 。0 1 m L l 乳鼠) 3 d -2 1 d 期間出現(xiàn)毛聳、 弓背、 肢體麻痹等發(fā)病者為可能陽 性， 再進一步鑒定分離的病毒。如接種標本的小鼠2 1 d 內(nèi) 不發(fā)病則宜將小鼠腦組織研磨成1 0 %懸液, 1 5 0 0 r 1m i n 離心3 0 m i n 后取上清液再作盲傳接種， 接種新的小鼠或細胞的培養(yǎng)， 盲傳三代陰性者作為分離病毒陰性。 雞胚對乙型腦炎病毒敏感， 將標本注射于7 - 9日 齡雞胚的腦或( 和) 絨毛尿囊膜， 放3 7 0C 孵育，2 d -5 d 后如雞胚發(fā)生死亡， 取雞胚或絨毛尿囊膜即可用于作乙腦病毒的鑒定( 雞胚分離病毒目 前已經(jīng)較少使用) 。A l . 1 . 4 常用的敏感細胞 流行性乙型腦炎病毒對許多種體外培養(yǎng)的細胞敏感， 可用于分離病毒， 常用的有雞胚纖維母細胞、人胚腎細胞、 人胚肺細胞、 豬腎、 地鼠腎、 猴腎細胞， 受感染的細胞能出現(xiàn)明顯的細胞病變。蟻傳代細胞C s 1 3 6 株乳地鼠腎$ H K 。 株或猴腎V e r o 傳代株細胞對乙型腦炎病毒敏感。A l . 2 病毒鑒定 用中和試驗進行鑒定， 如病毒的感染力能被抗乙 型腦炎免疫血清中和， 則可定為乙型腦炎病毒， 方法見A 2 . l eA 2 血清學診斷方法A 2 . 1 中和試驗A 2 . ， . 1 原理 中和抗體與病毒相結(jié)合， 能改變病毒表面的構(gòu)形， 使病毒不能與敏感細胞表面的受體相結(jié)合， 不能使敏感細胞發(fā)生病毒感染而產(chǎn)生細胞病變。 中和試驗以側(cè)定病毒的感染力為墓礎， 必須在敏感的動物或細胞中進行， 病毒與中和抗體之間， 具有質(zhì)和量的相關(guān)性。 乙型腦炎病毒只能被抗乙腦中和抗體所中和，抗體量的多少決定病毒被中和的完全程度。 因此， 中和試驗可用于鑒定病毒， 亦可用于測定抗體， 中和抗體滴度的高低與機體抗病毒的保護力呈正相關(guān)。WS 2 1 4 -2 0 0 1A 2 . 1 . 2 固定病毒用量稀釋血清法A 2 . ， . 2 . 1 病毒 先在敏感細胞或動物中測定病毒的5 0 % 致細胞病變量( T C I D s o ) 或動物的半數(shù)致死量( L D s o ) ， 用于固定病毒一 稀釋血清中和試驗的 病毒用量， 為1 0 0 T C I D s o / 0 . 1 m L ， 允許范圍為3 2 -3 2 0 T C I D s o ,A 2 . 1 . 2 . 2 滅活血清 將血清標本加等量H a n k s 液后于5 6 C O O m i n 滅活。A 2 . 1 . 2 . 3 準備生長成片， 形態(tài)良 好的細胞管若干支。 操作步驟: 。 ) 將已滅活的血清用H a n k 。 液作連續(xù) 2 倍的稀釋， 即1 ! 4 , 1 : 8 , 1 ! 1 6 , 1 : 3 2 , 1 : 6 4 , 1 : 1 2 8每稀釋度的量按接種試管數(shù)的需要而定， 如每一稀釋度接種。 . 1 m L ， 則需配0 . 5 m L ， 實際需用0 . 4 mL, b ) 取 I O O T C I D s o / 0 . 1 m L濃度的病毒分別與一系列稀釋的血清等盆相加， 充分搖勻， 放3 7 C 水箱作用I h . 其間搖勻2 - 3 次。 c ) 取出上述病毒與血清混懸液， 每一稀釋度接種4 管， 每管0 . 2 m L ， 補充維持液至1 m L , d ) 另設同批病毒毒力滴度對照， 選擇1 0 - 4 _1 0 - “ 的病毒， 每稀釋度接種4 管， 每管0 . 1 m L于同批細胞管并補充維持液至1 m L , e ) 另取同批細胞管4 支， 加1 m L維持液作為正常細胞對照。 f ) 所有上述細胞管明確標簽后， 塞緊像皮塞放 3 7 培養(yǎng)， 逐日觀察并記錄結(jié)果， 一般需觀察7d 一1 4 d , 根據(jù)細胞病變情況按式( DI M 計算中和 抗體的效價， 見式 A l ) , ( A 2 ) . 表A 1 5 0 寫 血清中 和終點的計算血清稀釋度細胞病變管/ 總管數(shù)細胞病交分布盡計比數(shù)百分比 %( +) 管( 一) 管( +) 告( 一) 個I， 4 00 - -)1: 8 ( 1 0 - )1， 1 6 ( 1 0 - )1， 3 2 ( 1 0 - )1 6 4 ( 1 0 - )1， 1 2 8 ( 1 0 一 2 一 1 )0 / 40 / 40 / 41 / 43 / 44 / 40 40 40 41 33 14 00 1 60 1 20 81 44 18 00 / 1 60 / 1 20 / 81 / 54 / 58 / 8 0 0 02 08 01 0 0A =5 0 % 一X。X， 一 X, “ “ ” ， “ ” 一 (AI) 1 g y , =I g 凡 +A， I g K , “ “ ” ” 一 ( A 2 )式中: A - 距離比例， X 低于5 0 %的病變率， X z - 高于5 0 寫的病變率。 Y , 血清的中和效價; K , 低于5 0 % 病變率的血清的稀釋度; K 稀釋系數(shù)。x 2 . 1 . 3 固定血清-一 稀釋病毒法A 2 . 1 . 3 . 1 病毒、 血清和小鼠的準備x 2 . 1 . 3 . 1 . 1 無菌法取發(fā)病瀕死的小鼠腦組織， 稱重， 加稀釋液( 1 0 %脫脂奶或緩沖液) 配成 2 X 1 0 - 1 懸液( 即每克腦組織加 4 m L液) ， 研磨后 3 0 0 0 r / mi n離心 2 0 mi n ， 取上懸液備用。WS 2 1 4 -2 0 0 1A 2 . 1 - 3 - 1 . 2 無菌法取血， 待凝固后 1 5 0 0 r / m i n低速離心 1 5 m i n ， 分離血清, 5 6 C 3 0 m i n 滅活處理。A 2 . 1 . 3 . 1 . 3 三周齡( 7 -9 g ) 健康小鼠若于只。A 2 . 1 - 3 . 2 操作步驟A 2 . 1 - 3 - 2 . 1 無菌法將 2 x1 0 - 病毒懸液連續(xù) 1 0 倍稀釋， 即2 x1 0 - - 2 , 2 XI O . . . . . . . . ， 方法基本同上。A 2 . 1 - 3 - 2 . 2 取若干支無菌試管組成方陣排列， 每排由5 -6 管組成。每排加一種待測血清， 第二排加另一份待測血清每管加血清量為0 . 1 m l ， 最后一排加 。1 mL稀釋液作為病毒對照組。A 2 . 1 - 3 . 2 . 3 分別于每管中加人等量不同稀釋度的病毒懸液， 0 . 1 M L / 管， 搖勻后放3 7 C , 1 h a稀釋度的選擇， 以最高稀釋度要求動物全活， 最低稀釋度動物全死為適度A 2 . 1 - 3 . 2 . 4 用無菌注射器吸取病毒一 血清混合液， 注射于小鼠腦內(nèi)， 0 . 0 3 ml , / 鼠， 每稀釋度注射 5 只，養(yǎng)于同一鼠罐內(nèi)。A 2 . 1 - 3 - 2 . 5 逐日 觀察動物死亡情況， 觀察時間根據(jù)病毒和接種途徑而定。乙腦病毒腦內(nèi)接種一般觀察 1 4 d ,A 2 . 1 - 3 . 3 中和指數(shù)的計算 R e e d和Mu e n c h 方法分別計算對照組動物半數(shù)致死量( I . D , o ) 和加免疫血清中和組的L D s a ( L D s 計算見式( M ) , ( AM . 表 A 2 L D .,。 的計算病 毒稀釋度接種鼠數(shù)活鼠 數(shù)死鼠 數(shù)積累總計A tIx死亡率 ( 外 )活鼠 d死鼠 個1 0 )1 0 “1 0 1 0t o.0555s001a555a1000151 01 51 O3101 5 八51 0 / 1 05 廠 6 1 / 60 / 1 01 0 01 0 08 31 7 0A =X3 一 5 0X。 一 X, . 。 . . . . 。 一. . . . . . . . . . . . . . . . . . ( A3) 1 z =1 g K, +A l g K, ( A 4)式中: A距離比例; X 3 一 高于5 0 %的死亡百分數(shù); X 低于5 0 %的死亡百分數(shù); Y , 病毒的L D , o ; K , 一 一 高于5 0 %死亡率的稀釋度; K3 稀釋系數(shù)。A 2 . 1 - 3 . 4 結(jié)果判定: 固定血清稀釋病毒者， 當中和指數(shù)大于 5 0 ， 表示未知血清有中和抗體， 1 0 -4 9 屬可疑， 小于 1 0 表示無中和能力。A 2 . 1 . 4 微量法中和試驗 ( ) 微量法中和試驗即采用固定病毒一 稀釋抗體法( 見A 2 . 1 . 2 ) ， 所不同之處是在4 0 孔或 9 6 孔塑料板中培養(yǎng)的細胞中進行， 以一孔代替一試管 ( 2 ) 病毒和血清的用量改為各加 。 . 0 2 5 m Lo ( 3 ) 塑料板上的細胞加蓋后放在 5 %的二氧化碳 3 7 C的孵箱中培養(yǎng)， 其簡明流程如下: 0 . 0 2 5 m l病毒懸液( 含1 0 0 T C I D s 。 病毒量) +0 . 0 2 5 m l待測血清3 5 3 7 0C 1 h 結(jié)合， 其間振蕩2 -3 次， 在充分結(jié)合后， 再在每一小孔中加人0 . 0 5 細胞懸液( p H 7 . 2 - 7 . 4 ， 細胞量約為1 X1 0 0 / 0 . 1 M L ) t o蓋后放人 3 7 C含 5 %的 C 02 孵箱中靜置培養(yǎng)， 逐 日觀察細胞病變并記錄結(jié)果 ， 觀察 7 天或更長， 其中和WS 2 1 4 -2 0 0 1抗體效價的記算方法同A 2 . 1 . 2 ,A 2 . 2 捕捉法E L I S A查乙腦搶 M抗體A 2 . 2 - 1 原理 乙型腦炎病毒感染后機體的最早的免疫應答反應是產(chǎn)生I g M機體， 由于乙腦的潛伏期為4 d -2 1 d . 平均為1 0 d -1 4 d 。 故一旦出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀， 從血中或腦脊液中就可能查到特異性的壇 M抗體 一般娘 M抗體持續(xù)存在一個月左右， 查到館 M抗體， 尤其是在腦脊液中查到I g M抗體， 結(jié)合癥狀就可以診斷乙型腦炎。 描捉法E L I S A試驗， 即利用包被在聚苯乙 烯塑料板上的抗人壇 M抗體， 捕捉感染者標本中的壇 M抗體， 又利用乙腦抗原與I g M抗體的特異性結(jié)合， 再用酶標抗乙腦抗體， 檢測已結(jié)合于I g M抗體的乙 腦抗原， 方法特異敏感出 結(jié)果快速， 適用于早期快速診斷。A 2 . 2 . 2 步驟A 2 - 2 , 2 . 1 將4 0 孔或9 6 孔塑料板的每孔用羊抗人I g M p 鏈抗體包被， 每孔1 0 0 V I - 3 7 水浴2 h 后4 C 過夜， 次日甩: 干。A 2 . 2 . 2 . 2 1 0 %的正常牛血清或1 %牛血清白蛋白生理鹽水每孔 1 5 0 川 3 7 封閉1 h 后倒去此液體。A 2 . 2 . 2 . 3 按每孔 1 0 0醉一 量分別加 1 : 1 0 。 稀釋的待測血清( 或 1 : 1 的腦脊液) 3 7 C1 . 5 h , 倒去血清后并用含吐溫- 2 0 的生理鹽水洗液洗三次， 再甩干。A 2 . 2 - 2 - 4 在加血清( 或腦脊液) 的孔內(nèi)分別加1 0 0 p L乙型腦炎抗原于二個孔， 加正常對照抗原于另二孔， 3 7 C 作用 3 h ( 或4 C過夜) ， 用洗液洗三次， 再甩干。A 2 . 2 . 2 . 5 每孔中加人 1 0 0 p L標本的兔抗乙腦血清, 3 7 C1 h 后， 洗三次甩干A 2 . 2 . 2 . 6 加羊抗兔I g G血清一 辣根過氧化酶結(jié)合物l 0 0 川/ 孔， 3 7 C l h 后用洗液洗三次， 甩千。A 2 , 2 . 2 . 7 每孔加鄰苯二胺一 過氧化氫底物 1 0 0 FA/ 孔3 7 C 作用待對照抗原孔開始顯色的瞬間( 一般2 -1 0 m i n ) 立即加2 M H M S O ; 液5 0 f I 終止反應。A 2 . 2 . 2 . 8 測每一孔的( ) D值。A 2 . 2 . 29 按式( A5 ) 判斷結(jié)果、 一 N , - NN , - N 2 . ， . 。 ， (AS)式中 M 一一M， 大于2 . 1 者判為陽性; N一 一標本十乙腦抗原孔的O D值; N, - 一 空白孔O D值; N 標本+正?？乖瓕φ湛椎腛 D值。 附錄B ( 提示的附錄)間接法E L I S A查乙腦I g G抗體B l 原 理 利用包被在塑料孔中的乙型腦炎抗原去吸附人的抗乙型腦炎抗體， 再用兔抗人I g G的酶標記物和酶的a 色劑去檢出有無人壇 G被抗原吸附， 從而測得抗乙腦壇 G抗體的存在。所用的包被抗原成份不同 所檢測的都是與之相對應的抗體， 一般用乙腦的全病毒抗原作檢測， 故它測出的不但有中和抗體， 而且還有乙腦的非中和抗體。B 1 門操作步驟B 1 . 1 . 1 將乙腦抗原和正常對照抗原定量后分別包被于 4 0 孔(