GB5009.240-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中伏馬毒素的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中伏馬毒素的測(cè)定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1發(fā)布2 0 1 7 - 0 3 - 0 1實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā) 布G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T2 5 2 2 82 0 1 0 糧油檢驗(yàn) 玉米及其制品中伏馬毒素含量測(cè)定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法和熒光光度法 、S N/T1 9 5 82 0 0 7 進(jìn)出口食品中伏馬毒素B1殘留量檢測(cè)方法 酶聯(lián)免疫吸附法 、S N/T1 5 7 22 0 0 5 進(jìn)出口糧谷中伏馬毒素檢驗(yàn)方法 高效液相色譜法 。本標(biāo)準(zhǔn)將以上標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了整合, 主要修訂如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測(cè)定” ; 伏馬毒素種類增加為伏馬毒素B1、B2、B3三種; 增加了免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法作為第一法; 增加了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法作為第二法; 取消熒光光度法; 改變了樣品提取溶液; 改變了免疫親和柱凈化-柱前衍生高效液相色譜法流動(dòng)相的組成。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中伏馬毒素的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米及其制品中伏馬毒素B1、 伏馬毒素B2、 伏馬毒素B3( 以下簡(jiǎn)寫為F B1、F B2、F B3)的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法為免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法, 第二法為高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法, 第三法為免疫親和柱凈化-柱前衍生高效液相色譜法, 適用于玉米及其制品中伏馬毒素的測(cè)定。第一法 免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法2 原理樣品用乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過(guò)免疫親和柱凈化, 去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜分離后柱后鄰苯二甲醛衍生, 熒光檢測(cè), 外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。3.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。3.1.4 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.5 氯化鈉(N a C l) 。3.1.6 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。3.1.7 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。3.1.8 氯化鉀(K C l) 。3.1.9 硼砂(N a2B4O71 0 H2O) 。3.1.1 0 2 -巰基乙醇(C2H6O S) 。3.1.1 1 鄰苯二甲醛(O P A,C8H6O2) 。3.1.1 2 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。3.2 溶液配制3.2.1 甲酸水溶液(0.1%) : 吸取1m L甲酸, 加入到9 9 9m L水中, 混合均勻。3.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。3.2.3 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 62 3.2.4 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。3.2.5 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉4.0g, 溶于1 0 0m L水, 混合均勻。3.2.6 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用9 8 0m L水溶解, 用鹽酸調(diào)整p H至7.4, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。3.2.7 吐溫- 2 0/P B S溶液(0.1%) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(3.2.6) 并稀釋至10 0 0m L,混合均勻。3.2.8 硼砂溶液(0.0 5m o l/L,p H1 0.5) : 稱取硼砂1 9.1g, 溶于9 8 0m L水中, 用氫氧化鈉溶液調(diào)p H至1 0.5, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。3.2.9 衍生溶液: 稱取2 .0g鄰苯二甲醛, 溶于2 0m L甲醇中, 用硼砂溶液(0 .0 5m o l/L,p H1 0 .5) (3 .2 .8) 稀釋至5 0 0m L, 加入2 -巰基乙醇5 0 0L, 混勻, 裝入棕色瓶中, 現(xiàn)用現(xiàn)配。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品3.3.1 伏馬毒素B1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.3.2 伏馬毒素B2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.3.3 伏馬毒素B3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(0.1m g/m L) : 分別準(zhǔn)確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒杯中, 用乙腈-水溶液(3.2.2) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光-2 0保存。有效期6個(gè)月。3.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液: 準(zhǔn)確吸取F B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1m L、F B2和F B3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5m L至同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈-水溶液(3.2.2) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度為5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B1濃度為1g/m L、F B2和F B3濃度為0.5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液密封后避光4保存, 有效期6個(gè)月。3.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 用乙腈-水溶液(3.2.3) 稀釋, 配制成F B1濃度依次為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、4 0 0n g/m L,F B2和F B3濃度依次為1 0n g/m L、4 0n g/m L、8 0n g/m L、1 2 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 0 0n g/m L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀, 帶熒光檢測(cè)器。4.2 柱后衍生系統(tǒng)。4.3 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。4.4 均質(zhì)器。4.5 振蕩器。4.6 氮吹儀。4.7 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。4.8 免疫親和柱( 柱容量50 0 0n g,F B1柱回收率8 0%) ( 柱容量及柱回收率驗(yàn)證方法參見附錄B) 。注:對(duì)于每個(gè)批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。4.9 微孔濾膜:0.4 5m, 有機(jī)型。5 分析步驟5.1 樣品制備將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機(jī)磨碎并細(xì)至粒度小于1mm, 混勻分成2份作G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 63 為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。在制樣的操作過(guò)程中, 應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。5.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取固體樣品5g( 精確至0.0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入2 0m L乙腈-水溶液(3.2.2) ,渦旋或振蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。5.3 試樣凈化取2m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(3.2.7) , 混合均勻后過(guò)免疫親和柱, 流速控制在1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液(3.2.4) 洗脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液,5 5 下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(3.2.3) 溶解殘?jiān)u旋3 0s, 過(guò)0.4 5m微孔濾膜后, 收集于進(jìn)樣瓶中, 待測(cè)。注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實(shí)際操作時(shí), 請(qǐng)參照廠商提供的操作說(shuō)明和程序使用。5.4 儀器參考條件色譜柱:C1 8色譜柱:2 5 0mm4.6mm,5m, 或相當(dāng)者。檢測(cè)波長(zhǎng): 激發(fā)波長(zhǎng)3 3 5n m; 發(fā)射波長(zhǎng)4 4 0n m。流動(dòng)相:A: 甲酸水溶液(3.2.1) ;B: 甲醇。梯度洗脫, 洗脫程序見表1。流動(dòng)相流速:0.8m L/m i n。衍生液流速:0.4m L/m i n。柱溫:4 0。反應(yīng)器溫度:4 0。進(jìn)樣量:5 0L。表1 流動(dòng)相洗脫程序時(shí)間m i n流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%0.0 04 5.05 5.02.0 04 5.05 5.09.0 03 0.07 0.01 4.0 01 0.09 0.01 4.5 01 0.09 0.01 5.0 04 5.05 5.02 2.0 04 5.05 5.05.5 試樣溶液的測(cè)定在5.4項(xiàng)色譜條件下, 將5 0.0L系列伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(3.4.3) 按濃度從低到高依次注入高效液相色譜儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(x軸) , 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y軸) , 對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行最小二乘線性擬合, 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按式(1) 計(jì)算:G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 64 y=a x+b(1) 式中:y 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比;a 回歸曲線的斜率;x 目標(biāo)物質(zhì)的濃度;b 回歸曲線的截距。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi), 如果樣品含量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍, 需稀釋后再測(cè)定。5.6 空白試驗(yàn)不稱取試樣, 按5.2和5.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。6 分析結(jié)果的表述待測(cè)樣品中F B1、F B2、F B3的含量按式(2) 計(jì)算:X=ciVfm(2) 式中:X 待測(cè)樣品中F B1、F B2、F B3的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;ci 待測(cè)物進(jìn)樣液中F B1、F B2、F B3的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 試液稀釋倍數(shù);m 樣品的稱樣量, 單位為克(g) 。注:計(jì)算結(jié)果需扣除空白值, 測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。7 精密度樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2 0%。8 其他當(dāng)稱樣量為5g時(shí),F B1、F B2、F B3的檢出限分別為1 7g/k g、8g/k g、8g/k g; 定量限分別為5 0g/k g、2 5g/k g、2 5g/k g。第二法 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法9 原理樣品加入同位素內(nèi)標(biāo), 乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過(guò)免疫親和柱或強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱凈化,去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過(guò)高效液相色譜分離, 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè), 同位素內(nèi)標(biāo)法定量。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 65 1 0 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。1 0.1 試劑1 0.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 0.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 0.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。1 0.1.4 氯化鈉(N a C l) 。1 0.1.5 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。1 0.1.6 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。1 0.1.7 氯化鉀(K C l) 。1 0.1.8 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。1 0.2 溶液配制1 0.2.1 甲酸水溶液(0.1%) : 吸取1m L甲酸, 加入到9 9 9m L水中, 混合均勻。1 0.2.2 乙腈-甲醇溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L甲醇和5 0 0m L乙腈, 混合均勻。1 0.2.3 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。1 0.2.4 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。1 0.2.5 甲醇-水溶液(6 0+2 0) : 分別量取6 0 0m L甲醇和2 0 0m L水, 混合均勻。1 0.2.6 甲醇-乙酸溶液(9 9+1) : 吸取1m L乙酸, 加入到9 9m L甲醇中, 混合均勻。1 0.2.7 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。1 0.2.8 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用9 8 0m L水溶解, 用鹽酸調(diào)整p H至7.4, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。1 0.2.9 吐溫- 2 0/P B S溶液(0 .1 %) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(1 0 .2 .8) 并稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品1 0.3.1 F B1、F B2、F B3標(biāo)準(zhǔn)品伏馬毒素B1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。伏馬毒素B2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。伏馬毒素B3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。1 0.3.2 1 3C3 4-伏馬毒素B1、B2、B3同位素內(nèi)標(biāo)1 3C3 4-伏馬毒素B1(1 3C3 4- F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。1 3C3 4-伏馬毒素B2(1 3C3 4- F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。1 3C3 4-伏馬毒素B3(1 3C3 4- F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。注:在檢測(cè)中可以只使用1 3C3 4- F B1一種同位素內(nèi)標(biāo), 但需要對(duì)被測(cè)定試樣基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn), 評(píng)估和確定1 3C3 4- F B1與其他被測(cè)伏馬毒素的基質(zhì)效應(yīng)。或使用基質(zhì)匹配校正曲線。1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(0.1m g/m L) : 分別準(zhǔn)確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 66 杯中, 用乙腈-水溶液(1 0.2.3) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0 m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光-2 0保存。有效期6個(gè)月。1 0.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液: 準(zhǔn)確吸取F B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1m L、F B2和F B3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5m L至同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 0.2.3) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度分別為5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B1濃度為1g/m L、F B2和F B3濃度分別為0 .5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液密封后避光4保存。有效期6個(gè)月。1 0.4. 3 混 合同位素標(biāo) 準(zhǔn)溶液: 準(zhǔn)確 吸取1 3C3 4- F B1(2 5g/m L) 、1 3C3 4- F B2(1 0g/m L) 、1 3C3 4- F B3(1 0g/m L) 各1m L至同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 0.2.3) 稀釋至刻度, 得到含1 3C3 4- F B12.5g/m L、1 3C3 4- F B2和1 3C3 4- F B31g/m L的混合同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液。再稀釋1 0倍, 得到含1 3C3 4- F B12 5 0n g/m L、1 3C3 4- F B2和1 3C3 4- F B31 0 0n g/m L的混合同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。有效期6個(gè)月。1 0.4.4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 用乙腈-水溶液(1 0.2.4) 稀釋, 加入混合同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 0 .4 .3) , 配制成F B1濃度依次為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、4 0 0n g/m L,F B2和F B3濃度依次為1 0n g/m L、4 0n g/m L、8 0n g/m L、1 2 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 0 0n g/m L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工 作溶液, 每個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液中含有1 3C3 4- F B12 5n g/m L、1 3C3 4- F B2和1 3C3 4- F B31 0n g/m L。 1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀: 配有電噴霧離子源。1 1.2 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。1 1.3 均質(zhì)器。1 1.4 振蕩器。1 1.5 氮吹儀。1 1.6 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。1 1.7 強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱( 硅膠基,6m L,5 0 0m g) 。1 1.8 免疫親和柱( 柱容量 50 0 0n g,F B1柱回收率 8 0 %) 。( 柱容量及柱回收率驗(yàn)證方法參見附錄B)注:對(duì)于每個(gè)批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。1 1.9 微孔濾膜:0.2 2m, 有機(jī)型。1 2 分析步驟1 2.1 樣品制備將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機(jī)磨碎并細(xì)至粒度小于1mm, 混勻分成2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。在制樣的操作過(guò)程中, 應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。1 2.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取固體樣品5g( 精確至0.0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入混合同位素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 0.4.3)4 0 0L, 加入2 0m L乙腈-水溶液(1 0.2.3) , 渦旋或振蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 67 1 2.3 試樣凈化1 2.3.1 免疫親和柱凈化取2m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(1 0.2.9) , 混合均勻后過(guò)免疫親和柱, 流速控制在1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液(1 0.2.8) 淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液(1 0.2.7) 洗脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液,5 5下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(1 0.2.4) 溶解殘?jiān)?。渦旋3 0s, 過(guò)0.2 2m微孔濾膜后, 收集于進(jìn)樣瓶中, 待測(cè)。注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實(shí)際操作時(shí), 請(qǐng)參照廠商提供的操作說(shuō)明和程序使用。1 2.3.2 強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱凈化取3m L提取液, 加入8m L甲醇-水溶液(1 0.2.5) , 混合均勻后過(guò)強(qiáng)陰離子交換固相萃取柱( 使用前按要求活化) , 分別用8m L甲醇-水溶液(1 0.2.5) 和3m L甲醇淋洗, 用1 0m L甲醇-乙酸溶液(1 0.2.6) 洗脫,5 5下氮吹至干, 加入1m L乙腈-水溶液(1 0.2.4) 溶解殘?jiān)?。渦旋3 0s, 過(guò)0.2 2m微孔濾膜后, 收集于進(jìn)樣瓶中, 待測(cè)。1 2.4 儀器參考條件1 2.4.1 液相色譜條件色譜柱:C1 8柱,1 0 0mm2.1mm,1.7m, 或相當(dāng)者。流動(dòng)相:A: 甲酸水溶液(0.1%) ;B: 乙腈-甲醇溶液(5 0+5 0) 。梯度洗脫, 梯度見表2。流速:0.3 5m L/m i n。柱溫:3 0。進(jìn)樣量:1 0L。表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序時(shí)間m i n流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%0.0 07 0.03 0.02.3 03 0.07 0.04.0 03 0.07 0.04.2 001 0 04.8 001 0 05.0 07 0.03 0.01 2.4.2 質(zhì)譜參數(shù)離子化模式: 電噴霧電離正離子模式(E S I +) 。質(zhì)譜掃描方式: 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 。監(jiān)測(cè)離子對(duì)信息見表3, 其他儀器參考條件見附錄C。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 68 表3 質(zhì)譜參數(shù)毒素名稱母離子定量子離子碰撞能量e V定性子離子碰撞能量e VF B17 2 23 5 22 53 3 43 5F B27 0 63 3 63 53 5 43 0F B37 0 63 3 63 53 5 43 01 3C3 4- F B17 5 63 7 43 53 5 64 01 3C3 4- F B27 4 03 5 83 53 7 63 01 3C3 4- F B37 4 03 5 83 53 7 63 01 2.5 定性判定用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)樣品進(jìn)行定性判定, 在相同試驗(yàn)條件下, 樣品中應(yīng)呈現(xiàn)定量離子對(duì)和定性離子對(duì)的色譜峰, 被測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間一致; 樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度比的偏差不超過(guò)表4規(guī)定范圍, 則可以判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)。表4 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度(k)k5 0%5 0%k2 0%2 0%k1 0%k1 0%允許的最大偏差2 0%2 5%3 0%5 0%1 2.6 定量測(cè)定在5.4高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下, 將1 0.0L系列伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 0.4.4) 按濃度從低到高依次注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)(x軸) , 目標(biāo)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)(y軸) , 對(duì)各個(gè)數(shù)值點(diǎn)進(jìn)行最小二乘線性擬合, 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按式(3) 計(jì)算:y=a x+b(3) 式中:y 目標(biāo)物質(zhì)/內(nèi)標(biāo)的峰面積比;a 回歸曲線的斜率;x 目標(biāo)物質(zhì)/內(nèi)標(biāo)的濃度比;b 回歸曲線的截距。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi), 如果含量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍,則重新取樣, 增加相應(yīng)內(nèi)標(biāo)添加量, 使內(nèi)標(biāo)濃度與待測(cè)液濃度相匹配, 然后稀釋到適當(dāng)濃度后分析。1 2.7 空白試驗(yàn)不稱取試樣, 按1 2.2和1 2.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 69 1 3 分析結(jié)果的表述本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。含量按式(4) 計(jì)算:X=cciAAsiVcsiAiAsm(4) 式中:X 樣品中待測(cè)組分的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;c 標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;ci 測(cè)定液中待測(cè)組分的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;A 測(cè)定液中待測(cè)組分的峰面積;Asi 標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;csi 標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;Ai 測(cè)定液中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;As 標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的峰面積;m 樣品稱樣量, 單位為克(g) 。注:計(jì)算結(jié)果需扣除空白值, 測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。1 4 精密度樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2 0%。1 5 其他當(dāng)稱樣量為5g時(shí),F B1、F B2、F B3的檢出限分別為7g/k g、3g/k g、3g/k g; 定量限分別為2 0g/k g、1 0g/k g、1 0g/k g。第三法 免疫親和層析凈化-柱前衍生高效液相色譜法1 6 原理樣品用乙腈-水溶液提取, 經(jīng)稀釋后過(guò)免疫親和柱凈化, 去除脂肪、 蛋白質(zhì)、 色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)。凈化液中的伏馬毒素經(jīng)過(guò)O P A衍生后進(jìn)高效液相色譜分離, 熒光檢測(cè), 外標(biāo)法定量。1 7 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。1 7.1 試劑1 7.1.1 甲醇(CH3OH) : 色譜純。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 61 0 1 7.1.2 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 7.1.3 乙酸(CH3C OOH) 。1 7.1.4 氫氧化鈉(N a OH) 。1 7.1.5 氯化鈉(N a C l) 。1 7.1.6 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。1 7.1.7 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。1 7.1.8 氯化鉀(K C l) 。1 7.1.9 硼砂(N a2B4O71 0 H2O) 。1 7.1.1 0 2 -巰基乙醇(C2H6O S) 。1 7.1.1 1 鄰苯二甲醛(O P A,C8H6O2) 。1 7.1.1 2 吐溫- 2 0(C5 8H1 1 4O2 6) 。1 7.2 溶液配制1 7.2.1 甲酸銨-甲酸水溶液(0.1m o l/L,p H:3.3) : 稱取6.3g甲酸銨, 溶于9 8 0m L水中, 用甲酸調(diào)p H至3.3, 用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。1 7.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 分別量取5 0 0m L乙腈和5 0 0m L水, 混合均勻。1 7.2.3 乙腈-水溶液(2 0+8 0) : 分別量取2 0 0m L乙腈和8 0 0m L水, 混合均勻。1 7.2.4 甲醇-乙酸溶液(9 8+2) : 吸取2m L乙酸, 加入到9 8m L甲醇中, 混合均勻。1 7.2.5 氫氧化鈉(1m o l/L) 溶液: 準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉4.0g, 溶于1 0 0m L水, 混合均勻。1 7.2.6 磷酸鹽緩沖液(P B S) : 稱取8.0g氯化鈉、1.2g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀, 用9 8 0m L水溶解, 然后用鹽酸調(diào)整p H至7.4, 最后用水稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。1 7.2.7 吐溫- 2 0/P B S溶液(0 .1 %) : 吸取1m L吐溫- 2 0, 加入磷酸鹽緩沖液(1 7 .2 .6) 并稀釋至10 0 0m L, 混合均勻。1 7.2.8 硼砂溶液(0.1m o l/L) : 稱取硼砂3.8g, 用水溶解并稀釋至1 0 0m L, 混合均勻。1 7.2.9 衍生溶液: 準(zhǔn)確稱取4 0m g鄰苯二甲醛, 溶于1m L甲醇中, 用硼砂溶液(0.1m o l/L) (1 7.2.8)5m L稀釋, 加入2 -巰基乙醇5 0L, 混合均勻, 裝入棕色瓶中, 現(xiàn)用現(xiàn)配。1 7.3 標(biāo)準(zhǔn)品F B1、F B2、F B3標(biāo)準(zhǔn)品:伏馬毒素B1(F B1,C3 4H5 9NO1 5) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。伏馬毒素B2(F B2,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。伏馬毒素B3(F B3,C3 4H5 9NO1 4) , 純度9 5%, 或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。1 7.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 7.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(0.1m g/m L) : 分別準(zhǔn)確稱取F B1、F B2、F B3各0.0 1g( 精確至0.0 0 01g) 至小燒杯中, 用乙腈-水溶液(1 7 .2 .2) 溶解, 并轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 定容至刻度。此溶液密封后避光- 2 0保存。有效期6個(gè)月。1 7.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液: 準(zhǔn)確吸取F B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1m L、F B2和F B3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0 .5m L至同一1 0m L容量瓶中, 加乙腈-水溶液(1 7.2.2) 稀釋至刻度, 得到F B1濃度為1 0g/m L、F B2和F B3濃度分別為5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再稀釋1 0倍, 得到F B1濃度為1g/m L、F B2和F B3濃度為0.5g/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液密封后避光4保存, 有效期6個(gè)月。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 61 1 1 7.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液: 準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 用乙腈-水溶液(1 7.2.3) 稀釋, 配制成F B1濃度依次為2 0n g/m L、8 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 4 0n g/m L、3 2 0n g/m L、4 0 0n g/m L,F B2和F B3濃度依次為1 0n g/m L、4 0n g/m L、8 0n g/m L、1 2 0n g/m L、1 6 0n g/m L、2 0 0n g/m L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。1 8 儀器和設(shè)備1 8.1 高效液相色譜儀, 帶熒光檢測(cè)器。1 8.2 天平: 感量0.0 1g和0.0 0 01g。1 8.3 均質(zhì)器。1 8.4 振蕩器。1 8.5 氮吹儀。1 8.6 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速40 0 0r/m i n。1 8.7 免疫親和柱( 柱容量 50 0 0n g,F B1柱回收率 8 0 %) ( 柱容量及柱回收率驗(yàn)證方法參見附錄A.2) 。注:對(duì)于每個(gè)批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證。1 8.8 微孔濾膜:0.4 5m, 有機(jī)型。1 8.9 秒表。1 9 分析步驟1 9.1 樣品制備將固體樣品按四分法縮分至1k g, 全部用谷物粉碎機(jī)磨碎并細(xì)至粒度小于1mm, 混勻分成2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。玉米油樣品直接取2份作為試樣, 分別裝入潔凈的容器內(nèi), 密封, 標(biāo)識(shí)后置于4下避光保存。在制樣的操作過(guò)程中, 應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。1 9.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取固體樣品5g( 精確至0.0 1g) 樣品于5 0m L離心管中, 加入2 0m L乙腈-水(1 7.2.2) , 渦旋或震蕩提取2 0m i n, 取出后, 在40 0 0r/m i n下離心5m i n, 將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。玉米油樣品操作同固體樣品, 提取液在下層。1 9.3 試樣凈化取2m L提取液, 加入4 7m L吐溫- 2 0/P B S溶液(1 7.2.7) , 混合均勻后過(guò)免疫親和柱, 流速控制在1m L/m i n 3m L/m i n, 用1 0m LP B S緩沖液淋洗免疫親和柱, 分別用1m L甲醇-乙酸溶液(1 7.2.4) 洗脫免疫親和柱三次, 收集洗脫液,5 5下氮吹至干, 加入5 0 0L乙腈-水溶液(1 7.2.2) 溶解殘?jiān)?。渦旋3 0s, 過(guò)0.4 5m微孔濾膜后, 收集于進(jìn)樣瓶中, 待測(cè)。注:由于不同廠商提供的免疫親和柱操作程序可能不同, 實(shí)際操作時(shí), 請(qǐng)參照廠商提供的操作說(shuō)明和程序使用。1 9.4 衍生取1 0 0L標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液于進(jìn)樣瓶中, 加入1 0 0L衍生溶液(1 7.2.9) , 渦旋混合3 0s, 在2m i n內(nèi)進(jìn)樣分析。G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 61 2 1 9.5 儀器參考條件色譜柱:C1 8柱,1 5 0mm4.6mm,5m或相當(dāng)者。檢測(cè)波長(zhǎng): 激發(fā)波長(zhǎng)3 3 5n m; 發(fā)射波長(zhǎng)4 4 0n m。流動(dòng)相:A: 甲酸銨-甲酸水溶液(1 7.2.1) ;B: 甲醇。梯度洗脫, 洗脫程序見表5。流速:1.0m L/m i n。柱溫:4 0。進(jìn)樣量:5 0L。表5 流動(dòng)相洗脫程序時(shí)間m i n流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%0.0 03 0.07 0.05.0 02 8.07 2.06.0 02 5.07 5.01 1.0 02 2.07 8.01 1.1 03 0.07 0.01 6.0 03 0.07 0.01 9.6 試樣溶液的測(cè)定在1 2.4色譜條件下, 將5 0.0L伏馬毒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 7.4.3) 按濃度從低到高依次注入高效液相色譜儀; 待儀器條件穩(wěn)定后, 以目標(biāo)物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)(x軸) , 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)(y軸) , 對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行最小二乘線性擬合, 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:y=a x+b(5) 式中:y 目標(biāo)物質(zhì)的峰面積比;a 回歸曲線的斜率;x 目標(biāo)物質(zhì)的濃度;b 回歸曲線的截距。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi), 如果樣品含量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍, 需稀釋后再測(cè)定。1 9.7 空白試驗(yàn)不稱取試樣, 按1 9.2和1 9.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。2 0 分析結(jié)果的表述X=ciVfm(6) 式中:X 待測(cè)樣品中F B1、F B2、F B3的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ;G B5 0 0 9.2 4 02 0 1 61 3 ci 待測(cè)物進(jìn)樣液中F B1、F B2、F B3的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 定容體積, 單位為毫升(m L) ;f 試液稀釋倍數(shù);m 樣品的稱樣量, 單位為克(g) 。注:計(jì)算結(jié)果需扣除空白值, 測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示, 保留兩位有效數(shù)字。2 1 精密度樣品中伏馬毒素含量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2 0%。