生物：1.2《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版選修3)-副本.ppt

基因工程的基本操作程序,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有啟動(dòng)子，下游有終止子,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因的種類,（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。 （2）沒有轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。 （3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因操作的基本步驟,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,一、目的基因的獲取,目的基因,1.目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫(kù)中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,1.概念：基因文庫(kù) （gene library）,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(kù)(gene library),基因組文庫(kù)的構(gòu)建,（2）.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因, cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),基因組文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù). 部分基因文庫(kù): 基因文庫(kù)中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫(kù)叫做部分基因文庫(kù).,基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,基因組文庫(kù),2基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一,（1）直接分離法(鳥槍法),某種生物的單鏈mRNA,單鏈互補(bǔ)DNA,雙鏈cDNA片段,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,與載體連接,cDNA文庫(kù),逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,cDNA合成過程,第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。 第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。,3.如何從基因文庫(kù)中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,4.為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？,構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。,2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。,PCR技術(shù),原理： 前提： 原料 方式,PCR擴(kuò)增儀,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴(kuò)增， 即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA； DNA引物； 四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560引物與部分模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈,2、具體過程,3. 人工合成,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測(cè),推測(cè),目的基因,化學(xué)合成,二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心,質(zhì)粒,DNA分子,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種 限制酶,目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。,目的： 組成：,1、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代， 2、使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn),基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素,（1）基因的特點(diǎn)：如果一個(gè)來自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯?dòng)物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動(dòng)物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個(gè)糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無這些細(xì)胞器。 （2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個(gè)組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。 （3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細(xì)胞,將目的基因?qū)?動(dòng)物細(xì)胞,將目的基因?qū)?微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法： （1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過程：,（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 方法：,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè): 是否插入目的基因 是否轉(zhuǎn)錄 是否翻譯 鑒定: 功能活性鑒定 抗性鑒定,分別提取什么進(jìn)行檢測(cè),歸納步驟,（一）、檢測(cè),1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關(guān)鍵步驟),首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,知識(shí)延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,歸納步驟,（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）,2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢查是否成功,檢測(cè),鑒定,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗