GB5413.37-2010 食品安全國家標準 乳和乳制品中黃曲霉毒素m1的測定

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.372010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標準 乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測定 National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products GB 5413.372010 I 前 言 本標準第一法對應(yīng)于ISO14501：2007 Milk and milk powder-determination of aflatoxin M1 content -clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography，本標準第一法與ISO14501： 2007的一致性程度為非等效； 本標準第二法和第三法代替GB/T 18980-2003；本標準第四法來自于NY/T 1664-2008牛乳中黃曲霉毒素M1的快速檢測 雙流向酶聯(lián)免疫法 。 本標準附錄A和附錄B為資料性附錄。 GB 5413.372010 1 食品安全國家標準 乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測定方法。 標準第一法適用于乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測定；第二法適用于乳、乳粉，以及低脂乳、脫脂乳、低脂乳粉和脫脂乳粉中黃曲霉毒素 M1的測定；第三法適用于乳和乳粉中黃曲霉毒素 M1的測定；第四法適用于液態(tài)乳和乳粉中黃曲霉毒素 M1的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 第一法 免疫親和層析凈化 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 3 原理 試樣液體或固體試樣提取液經(jīng)均質(zhì)、超聲提取、離心，取上清液經(jīng)免疫親和柱凈化，洗脫液經(jīng)氮氣吹干，定容，微孔濾膜過濾，經(jīng)液相色譜分離，電噴霧離子源離子化，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）方式檢測?；|(zhì)加標外標法定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。 4.1 甲酸（HCOOH） 。 4.2 乙腈 (CH3CN)：色譜純。 4.3 石油醚（CnH2n+2） ：沸程為30 60 。 4.4 三氯甲烷（CHCl3） 。 4.5 氮氣：純度99.9 %。 4.6 黃曲霉毒素M1標準樣品：純度98%。 4.7 乙腈-水溶液(1+4)：在400 mL水中加入100 mL乙腈。 4.8 乙腈-水溶液(1+9)：在450 mL水中加入50 mL乙腈。 4.9 0.1 % 甲酸水溶液：吸取1 mL 甲酸（4.1） ，用水稀釋至1000 mL。 4.10 乙腈-甲醇溶液（50+50） ：在500 mL乙腈中加入500 mL甲醇。 4.11 氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L） ：稱取2 g氫氧化鈉溶解于100 mL水中。 GB 5413.372010 2 4.12 空白基質(zhì)溶液 分別稱取與待測樣品基質(zhì)相同的、不含所測黃曲霉毒素的陰性試樣8份于100 mL燒杯中。以下操作按6.1試液提取和6.2 凈化步驟進行。合并所得8份試樣的純化液，用0.22 m 微孔濾膜的一次性濾頭（5.23）過濾。棄去前0.5 mL濾液，接取少量濾液供液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。 獲得色譜質(zhì)譜圖后，對照附錄 A 中的圖 A.2，在相應(yīng)的保留時間處，應(yīng)不含黃曲霉毒素 M1。剩余濾液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，在-20 電冰箱內(nèi)保存，供配制標準系列溶液使用。 4.13 黃曲霉毒素M1標準儲備溶液：分別稱取標準品黃曲霉毒素M1 0.10 mg（精確至0.01 mg） ，用三氯甲烷（4.4）溶解定容至10 mL。此標準溶液濃度為0.01 mg/mL。溶液轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中后，在-20 電冰箱內(nèi)保存，備用。 4.14 黃曲霉毒素M1標準系列溶液：吸取黃曲霉毒素M1 標準儲備溶液（4.13）10 L于10 mL容量瓶中，用氮氣將三氯甲烷吹至近干，空白基質(zhì)溶液（4.12）定容至刻度，所得濃度為10 ng/mL的M1標準中間溶液。再用空白基質(zhì)溶液（4.12）將黃曲霉毒素M1標準中間溶液稀釋為0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL的系列標準工作液。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶電噴霧離子源。 5.2 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T31，柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm；填料粒徑1.8 m，或同等性能的色譜柱。 5.3 天平：感量為0.001 g和0.00001 g。 5.4 勻漿器。 5.5 超聲波清洗器。 5.6 離心機：轉(zhuǎn)速6000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.7 50 mL具塞PVC離心管。 5.8 水浴:溫控30 士2 ，50 士2 ，溫度范圍25 60 。 5.9 容量瓶:100 mL。 5.10 玻璃燒杯:250 mL，50 mL。 5.11 帶刻度的磨口玻璃試管:5 mL，10 mL，20 mL。 5.12 移液管:1.0 mL，2.0 mL和50.0 mL。 5.13 玻璃棒。 5.14 10目圓孔篩。 5.15 250 mL分液漏斗。 5.16 100 mL圓底燒瓶。 5.17 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 1給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可，如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 GB 5413.372010 3 5.18 pH計：精度為0.01。 5.19 250 mL具塞錐形瓶。 5.20 免疫親和柱：針筒式 3 mL。 5.21 10 mL和50 mL一次性注射器。 5.22 固相萃取裝置（帶真空系統(tǒng)） 。 5.23 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜（水相系） 。 6 分析步驟 6.1 試液提取 6.1.1 乳：稱取50 g(精確至0.01 g)混勻的試樣，置于50 mL具塞離心管(5.7)中，在水浴(5.8) 中加熱到3537 。在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。收集全部上清液，供凈化用。 6.1.2 發(fā)酵乳(包括固體狀、 半固體狀和帶果肉型)： 稱取50 g(精確至0.01 g)混勻的試樣， 用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液 （4.11） 在酸度計(5.18)指示下調(diào)pH至7.4， 在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘下勻漿(5.4)5 min， 以下按 6.1.1 進行操作。 6.1.3 乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品：稱取 10 g(精確至0.01 g)試樣，置于250 mL 燒杯中。將50 mL 已預熱到50 的水加入到乳粉中，用玻璃棒將其混合均勻。如果乳粉仍未完全溶解，將燒杯置于50的水浴(5.8)中放置30 min。溶解后冷卻至20 ，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗滌燒杯，洗滌液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后分別移至兩個50 mL離心管(5.7)中，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。 6.1.4 干酪：稱取經(jīng)切細、過10目圓孔篩混勻的試樣5g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管(5 .7)中，加2 mL水和30 mL甲醇，在9500 轉(zhuǎn)/分鐘下勻漿5 min，超聲提取30 min，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3） ，振搖2 min，待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。重復用石油醚提取2次。將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL，濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4)（4.7）5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中，加水稀釋至約50 mL，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。 6.1.5 奶油：稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL石油醚(4.3)將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。 加20 mL水和30 mL甲醇， 振蕩30 min后， 將全部液體移于分液漏斗中， 待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（5.17）中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50 mL，供凈化處理。 6.2 凈化 6.2.1 免疫親和柱的準備 將一次性的50 mL注射器筒與親和柱(5.20)上頂部相串聯(lián)，再將親和柱與固相萃取裝置連接起來。 注：根據(jù)免疫親和柱的使用說明書要求，控制試液的pH值。 6.2.2 試樣的純化 將以上 6.1 試液提取液移至 50 mL 注射器筒(5.21)中，調(diào)節(jié)固相萃取裝置的真空系統(tǒng),控制試樣以 2 mL/分鐘3 mL/分鐘穩(wěn)定的流速過柱。取下 50 mL 的注射器筒，裝上 10 mL 注射器筒。注射器筒內(nèi)加入水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。脫開真空系統(tǒng)，在親和柱下部放入 10 mL 刻度試管，上部裝上另一個 10 mL 注射器筒， 加入 4 mL 乙腈(4.2),洗脫黃曲霉毒素 M1， 洗脫液收集在刻度試管中(5.11)中，洗脫時間不少于 60 秒。然后用氮氣緩緩地在 30 下將洗脫液蒸發(fā)至近干 (如果蒸發(fā)至干，會損失黃曲霉毒素 M1 )，用乙腈-水溶液（1+9）稀釋至 1 mL。 GB 5413.372010 4 6.3 液相色譜參考條件 流動相：A 液，0.1% 甲酸溶液；B 液，乙腈-甲醇溶液（1+1） 。 梯度洗脫：參見附錄A中的表A.1。 流動相流動速度：0.3 mL/min。 柱溫：35 。 試液溫度：20 。 進樣量：10 L。 6.4 質(zhì)譜參考條件 檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），詳見表1中母離子、子離子和碰撞能量。掃描圖參見附錄A中的圖A.1。 表1 離子選擇參數(shù)表 黃曲霉毒素 母離子 定量子離子 碰撞能量 定性子離子 碰撞能量 離子化方式 M1 329.0 273.5 22 259.5 22 ESI+ 離子源控制條件：參見附錄A中的表A.2。 6.5 定性 試樣中黃曲霉毒素 M1色譜峰的保留時間與相應(yīng)標準色譜峰的保留時間相比較， 變化范圍應(yīng)在2.5之內(nèi)。 黃曲霉毒素 M1的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于 3（S/N3） ， 定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于 10（S/N10） 。 每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物， 樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾龋?其允許偏差不超過表 2 規(guī)定的范圍。 表 2 定性時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度 50 20至 50 10至 20 10 允許相對偏差 20% 25% 30% 50% 各檢測目標化合物以保留時間和兩對離子（特征離子對/定量離子對）所對應(yīng)的 LC-MS/MS色譜峰面積相對豐度進行定性。要求被測試樣中目標化合物的保留時間與標準溶液中目標化合物的保留時間一致（一致的條件是偏差小于 20%） ，同時要求被測試樣中目標化合物的兩對離子對應(yīng) LC-MS/MS 色譜峰面積比與標準溶液中目標化合物的面積比一致。 6.6 試樣測定 按照 6.3 和 6.4 確立的條件，測定試液（6.2）和標準系列溶液（4.14）中黃曲霉毒素 M1的離子強度，外標法定量。色譜圖見附錄 A 的圖 A.2。 色譜參考保留時間：黃曲霉毒素 M1 3.23 min。 6.7 空白試驗 不稱取試樣，按6.5的步驟做空白實驗。應(yīng)確認不含有干擾被測組分的物質(zhì)。 6.8 標準曲線繪制 GB 5413.372010 5 將標準系列溶液（4.14）由低到高濃度進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。 6.9 定量測定 待測樣液中被測組分的響應(yīng)值應(yīng)在標準曲線線性范圍內(nèi)， 超過線性范圍時， 則應(yīng)將樣液用空白基質(zhì)溶液稀釋后重新進樣分析或減少取樣量，重新按6.1進行處理后再進樣分析。 7 分析結(jié)果的表述 外標法定量，按式（1）計算黃曲霉毒素M1的殘留量。 mfVAX1=（1） 式中: X試樣中黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每千克（g/kg） ； A試樣中黃曲霉毒素 M1的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL） ； V樣品定容體積，單位毫升（mL）； f樣液稀釋因子； m試樣的稱樣量，單位克（g） 。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。 第二法 免疫親和層析凈化高效液相色譜法 9 原理 親和柱內(nèi)含有的黃曲霉毒素 M1特異性單克隆抗體交聯(lián)在固體支持物上，當試樣通過親和柱時，抗體選擇性的與黃曲霉毒素 M1(抗原)鍵合，形成抗體抗原復合體。用水洗柱除去柱內(nèi)雜質(zhì)，然后用洗脫劑洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素 M1，收集洗脫液。用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀測定洗脫液中黃曲霉毒素 M1含量。 10 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。 10.1 免疫親和柱：親和柱的最大容量不小于100 ng黃曲霉毒素M1(相當于50 mL濃度為2 g/L的試樣)，當標準溶液含有4 ng黃曲霉毒素M1(相當于50 mL濃度為80 ng/L的試樣)時回收率不低于80 %。 應(yīng)該定期檢查親和柱的柱效和回收率，對于每個批次的親和柱至少檢查一次(見10.1.1和10.1.2)。 10.1.1 柱效檢查 用移液管(11.4)移取 1.0 mL 的黃曲霉毒素 M1標準儲備液(10.5.2)到 20 mL 的錐形試管中(11.9)。用恒流的氮氣(10.3)將液體慢慢吹干，然后用 10 mL l0 %的乙腈水溶液(10.2.2)溶解殘渣，用力搖蕩。 將該溶液加入到 40 mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱（10.1） 。按說明書要求使用免疫親和柱。淋洗免疫親和柱后，洗脫黃曲霉毒素 M1。將洗脫液進行適當稀釋后，用高效液相色譜儀測定免疫親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1含量。 計算黃曲霉毒素 M1的回收率，將其結(jié)果與 10.1 中所要求的指標進行比較。 GB 5413.372010 6 10.1.2 回收率檢查 用移液管(11.4)移取 0.8 mL 0.005 g/mL 的黃曲霉毒素 M1標準工作液(10.5.3)到 10 mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按說明書使用免疫親和柱。淋洗免疫親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1。將洗脫液進行適當稀釋后，用高效液相色譜儀測定免疫親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1含量。計算黃曲霉毒素 M1的回收率，將其結(jié)果與 10.1 中所要求的指標進行對比。 10.2 乙腈(CH3CN)：色譜純。 10.2.1 25 %乙腈水溶液：將250 mL的乙腈(10.2)與750 mL的水混溶(使用前需要脫氣)。 10.2.2 10 %乙腈水溶液：將100 mL的乙腈(10.2)與900 mL的水混溶(使用前需要脫氣)。 10.3 氮氣（N2） 。 10.4 三氯甲烷：加入0.5 %1.0 %質(zhì)量比(與三氯甲烷質(zhì)量比)的乙醇進行穩(wěn)定。 10.5 黃曲霉毒素M1標準溶液，純度98%。 10.5.1 濃度的校正 黃曲霉毒素 M1三氯甲烷標準溶液濃度為 10 g/mL。根據(jù)下面的方法，在最大吸收波段處測定溶液的吸光度，以確定黃曲霉毒素 M1的實際濃度。 用分光光度計（11.11）在 340 nm370 nm 處測定，扣除三氯甲烷的空白本底，讀取標準溶液的吸光度值。在接近 360 nm 最大吸收波段 max處，測得吸光度值為 A，根據(jù)式（2）計算濃度值： 100=MAci(2) 式中： ci黃曲霉毒素 M1實際濃度，單位為微克每毫升 ( g/mL)； A在max處測得的吸光度值； M328 g/mol，黃曲霉毒素 M1摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol） ； 19950，溶于三氯甲烷中的黃曲霉毒素 M1的吸光系數(shù)，單位為平方米每摩爾（m2/mol） 。 10.5.2 標準儲備液 確定黃曲霉毒素 M1標準溶液的實際濃度值后（10.5.1） ，繼續(xù)用三氯甲烷將其稀釋為濃度為 0.1 g/mL 的儲備液。儲備液密封后于冰箱中 5 以下避光保存。在此條件下，儲備液可以穩(wěn)定兩個月。 10.5.3 黃曲霉毒素M1標準工作液 從冰箱中取出標準儲備液（10.5.2）放置至室溫，移取一定量的儲備液進行稀釋制備成工作液。工作液臨用前配制。 黃曲霉毒素 M1標準工作液配制：用移液管（11.4）準確移取 1.0 mL 的儲備液（10.5.2）到 20 mL的錐形試管中（11.9） ，用和緩的氮氣（10.3）將溶液吹干，然后用 20.0 mL10 %的乙腈水溶液（10.2.2）將殘渣重新溶解，30 min 內(nèi)振搖，混勻，配成濃度為 0.005 g/mL 的黃曲霉毒素 M1標準工作液。在用氮氣對儲備液吹干的過程中，一定要仔細操作，避免因溫度降低太多而出現(xiàn)結(jié)露。 在作標準曲線時，黃曲霉毒素 M1的進樣絕對含量分別是 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng、0.4 ng。根據(jù)高效液相色譜儀進樣環(huán)的容積量，用工作液配置一系列適當濃度的黃曲霉毒素 M1標準溶液，稀釋液用 10 %乙腈水溶液（10.2.2） 。 11 儀器和設(shè)備 11.1 一次性注射器：10 mL和50 mL。 11.2 真空系統(tǒng)。 GB 5413.372010 7 11.3 離心機：轉(zhuǎn)速7000 轉(zhuǎn)/分鐘。 11.4 移液管：1.0 mL、2.0 mL和50.0 mL。 11.5 玻璃燒杯：250 mL。 11.6 容量瓶：100 mL。 11.7 水?。簻乜?0 2，50 2 ，溫度范圍361 。 11.8 濾紙：中速定性濾紙。 11.9 帶刻度的磨口錐形玻璃試管：5 mL、10 mL、20 mL。 11.10 高效液相色譜儀 11.10.1 無脈沖泵：適合恒定體積流量約1 mL/min的泵。 11.10.2 進樣系統(tǒng)：具有固定或可變?nèi)莘e的進樣環(huán)，進樣體積50 L500 L。 11.10.3 反相色譜柱：填充3 m或者5 m的十八烷基硅膠，加有填充反相材料的保護柱。 11.10.4 熒光檢測器：具有365 nm激發(fā)波長、435 nm發(fā)射波長，在適當?shù)纳V條件下能夠測定0.02 ng的黃曲霉毒素M1(相當于5倍噪音)。 11.11 紫外分光光度計：波長范圍為200 nm400 nm。 11.12 天平：感量為0.01 g。 12 分析步驟 所有的操作分析均應(yīng)在避光條件下進行。 12.1 試樣制備 12.1.1 乳：將試樣在水?。?1.7）中加熱到3537。用濾紙（11.8）過濾（根據(jù)情況，可以使用多層濾紙進行過濾） ，或者在7000 轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min。至少收集50 mL試樣，按照12.4繼續(xù)操作。 12.1.2 乳粉：稱取10 g樣品（精確到0.1 g） ，置于250 mL的燒杯（11.5）中。將50 mL已預熱到50的水多次少量地加入到乳粉中，用攪拌棒將其混合均勻。如果乳粉不能完全溶解，將燒杯在50的水浴（11.7）中放置至少30 min,仔細混勻。將溶解的乳粉冷卻至20后，移入100 mL容量瓶（11.6）中，用少量的水分次淋洗燒杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。用濾紙（11.8）過濾乳，或者在7000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。至少收集50 mL的乳試樣，按照12.4繼續(xù)進行分析。 12.1.3 發(fā)酵乳：按照“第一法”中6.1.2的前處理方法進行。 12.1.4 干酪：按照“第一法”中6.1.4的前處理方法進行。 12.1.5 奶油：按照“第一法”中6.1.5的前處理方法進行。 12.2 免疫親和柱的準備 將一次性的 50 mL 注射器筒（11.1）與親和柱（10.1）的頂部相連，再將親和柱與真空系統(tǒng)（11.2）連接起來。 12.3 試樣的提取與純化 用移液管移取 50 mL 試樣（12.1.1 或 12.1.2）到 50 mL 注射器（11.1）中，調(diào)節(jié)真空系統(tǒng)（11.2） ，控制試樣以 2 mL/min3 mL/min 穩(wěn)定的流速過柱。 取下 50 mL 的注射器，裝上 10 mL 注射器。注射器內(nèi)加入 10 mL 水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后， GB 5413.372010 8 抽干親和柱。 脫開真空系統(tǒng)，裝上另一個 10 mL 注射器，加入 4 mL 乙腈(10.2)。緩緩推動注射器栓塞，通過柱塞控制流速，洗脫黃曲霉毒素 M1，洗脫液收集在錐形管(11.9)中，洗脫時間不少于 60 s。然后用和緩的氮氣(10.3)在 30 下將洗脫液蒸發(fā)至體積為 50 L500 L(如果蒸發(fā)至干， 會損失黃曲霉毒素 M1)。再用水稀釋 10 倍至最終體積為 Vf(即 500 L5000 L)。 注：如果注入高效液相色譜儀含黃曲霉毒素 M1的樣品，乙腈含量超過 10，色譜峰變寬。如果水含量超過 90 ，則對色譜峰的形狀沒有影響。 12.4 高效液相色譜分析 12.4.1 色譜條件 色譜柱：C18，長25 cm，內(nèi)徑4.6 mm； 流動相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)； 流速：1 mL/min。 12.4.2 黃曲霉毒素M1的標準曲線 根據(jù)高效液相色譜儀進樣環(huán)容積，選擇適當進樣體積數(shù) Vi，分別注入含有 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng和 0.4 ng 的黃曲霉毒素 M1標準溶液。繪制成峰面積或峰高對黃曲霉毒素 M1質(zhì)量的標準曲線。 12.4.3 色譜分析 根據(jù)樣品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素 M1的峰高或峰面積值，從標準曲線上得出樣品洗脫液中所含有的黃曲霉毒素 M1質(zhì)量數(shù)(ng)。 如果樣品洗脫液的黃曲霉毒素 M1的峰面積或峰高值高于標準曲線范圍，用水定容稀釋樣品洗脫液后，重新進樣分析。 13 分析結(jié)果的表述 13.1 乳 應(yīng)用式(3)計算被測樣品中的黃曲霉毒素 M1的含量 m。 VVVmifAm=1（3） 式中： m黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每升( g/L)； mA樣品洗脫液黃曲霉毒素 M1的峰面積或峰高從標準曲線上得出的黃曲霉毒素 M1的質(zhì)量，單位為納克(ng)； Vi樣品洗脫液的進樣體積，單位為微升(L)； Vf樣品洗脫液的最終體積，單位為微升(L)； V通過免疫親和柱被測樣品的體積，單位為毫升(mL)。 式(3)適用于未經(jīng)稀釋的試樣，否則應(yīng)該乘以稀釋倍數(shù)。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 13.2 乳粉 應(yīng)用式(4)計算被測樣品中的黃曲霉毒素 M1的含量 p。 mVVmifAp=1 (4) GB 5413.372010 9 式中： p黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每千克(g/kg)； m50mL 樣液(12.3)中所含乳粉質(zhì)量，單位為克(g)。 mA、Vf、Vi的含義與 13.1 中所定義的一樣。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 14 精密度 各實驗室試驗結(jié)果的精密度總結(jié)于附錄 B 中，這些數(shù)據(jù)不適用于其他的污染水平和被測樣。 第三法 免疫層析凈化熒光分光度法 15 原理 試樣經(jīng)過離心、脫脂、過濾，濾液經(jīng)含有黃曲霉毒素M1特異性單克隆抗體的免疫親和柱層析凈化，黃曲霉毒素M1交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。 此抗體對黃曲霉毒素M1具有專一性， 當樣品通過親和柱時，抗體選擇性的與所有存在的黃曲霉毒素M1(抗原)鍵合。用甲醇-水(1+9)將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇-水(8+2)通過免疫親和柱洗脫，將溴溶液衍生后的洗脫液置于熒光光度計中測定黃曲霉毒素M1含量。 16 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。 16.1 甲醇(CH3OH):色譜純。 16.2 氯化鈉(NaCl)。 16.3 甲醇-水(1+9):取10 mL甲醇加入90 mL水。 16.4 甲醇-水(8+2):取80 mL甲醇加入20 mL水。 16.5 溴溶液儲備液(0.01 %):稱取適量溴，溶于水后，配成0.01%的儲備液，避光保存。 16.6 溴溶液工作液(0.002 %):取10 mL0.01 %的溴溶液儲備液加入40 mL水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩，F(xiàn)用現(xiàn)配。 16.7 二水硫酸奎寧(C20H24N2O2)2H2SO42H2O。 16.8 硫酸溶液(0.05 mol/L):取2.8 mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000 mL。 16.9 熒光光度計校準溶液:稱取0.340 g 二水硫酸奎寧， 用0.05 mol/L硫酸溶液 （16.8） 溶解并定容至100 mL，此溶液熒光光度計讀數(shù)相當于2.0 g/L黃曲霉毒素M1標準溶液。0.05 mol/L硫酸溶液（16.8）熒光光度計讀數(shù)相當于0.0 g/L黃曲霉毒素M1。 17 儀器和設(shè)備 17.1 熒光光度計。 17.2 離心機: 轉(zhuǎn)速7000 轉(zhuǎn)/分鐘。 17.3 玻璃纖維濾紙:直徑 11 cm，孔徑1.5 m。 GB 5413.372010 10 17.4 黃曲霉毒素M1免疫親和柱。 17.5 空氣壓力泵。 17.6 玻璃試管:直徑12 mm，長75 mm，無熒光特性。 17.7 玻璃注射器：10 mL。 18 分析步驟 18.1 試樣提取 18.1.1 乳：取 50.0 mL試樣，加入1.0 g氯化鈉（16.2），7000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10 min，小心移取用于分析的乳底脫脂層，不要碰觸頂部脂肪層，將脫脂的乳以玻璃纖維濾紙（17.3）過濾，濾液備用。 18.1.2 乳粉：稱取 5 g 試樣(精確至0.01 g)，用30 60 水將其慢慢溶解，定容至50 mL，加入1.0 g 氯化鈉（16.2），以下按18.2的步驟操作。 18.2 凈化 將免疫親和柱（17.4）連接于10 mL玻璃注射器（17.7）下。準確移取10.0 mL上述濾液（18.1）注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵（17.5）與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱（17.4），直至2 mL3 mL空氣通過柱體。以10 mL甲醇-水(1+9)（16.3）清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL3 mL空氣通過柱體。準確加入1.0 mL(V1)甲醇-水(8十2)（16.4）洗脫液洗脫，流速為1 mL/min2 mL/min，收集全部甲醇-水洗脫液于玻璃試管（17.6）中，備用。 18.3 測定 18.3.1 熒光光度計校準 在激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm條件下，以0.05 mol/L的硫酸溶液（16.8）為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值為 0.0 g/L； 以熒光光度計校準溶液（16.9）調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值2.0 g/L。 18.3.2 樣液測定 取上述洗脫液加入1.0 mL (V) 0.002 %溴溶液，1 min后立即于熒光光度計測定樣液中黃曲霉毒素M1含量c1。 18.3.3 空白試驗 用水代替試樣，按18.118.3 步驟做空白試驗。 19 分析結(jié)果的表述 19.1 乳 乳檢測結(jié)果按式(5)計算: VVCCX10)(1011=(5) 式中: X1試樣中黃曲霉毒素M1含量，單位為微克每升(g/L)； C1熒光光度計中讀取的樣液中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升(g/L)； C0熒光光度計中讀取的空白試驗中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升(g/L)； GB 5413.372010 11 V1最終凈化甲醇-水（8+2）洗脫液體積，單位為毫升(mL)； V通過親和柱試樣體積，單位為毫升(mL)； 10儀器的讀數(shù)系數(shù)。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留到小數(shù)點后一位。 19.2 乳粉 乳粉檢測結(jié)果按式(6)計算: mVVCCX=10)(1022(6) 式中: X2 試樣中黃曲霉毒素M1含量，單位為微克每千克(g/kg)； C2 熒光光度計中讀取的樣液中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升（g/L)； C0 熒光光度計中讀取的空白試驗中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升（g/L)； Vl 最終凈化甲醇-水(8+2)洗脫液體積，單位為毫升(mL)； V通過親和柱試樣體積，單位為毫升(mL)； m50 mL試樣中所含乳粉的質(zhì)量，單位為克每毫升(g/mL)； 10儀器的讀數(shù)系數(shù)。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留到小數(shù)點后一位。 第四法 雙流向酶聯(lián)免疫法 20 原理 利用酶聯(lián)免疫競爭原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標抗體反應(yīng)，多余的游離酶標抗體則與酶標板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過流動洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標準點比較定性。 21 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 21.1 黃曲霉毒素M1雙流向酶聯(lián)免疫試劑盒，2 7 保存。 21.1.1 黃曲霉毒素M1系列標準溶液。 21.1.2 酶聯(lián)免疫試劑顆粒（含特異性酶標抗體） 。 21.1.2.1 抗黃曲霉毒素M1抗體。 警告：不應(yīng)破損，否則立即銷毀。 21.1.2.2 酶結(jié)合物。 21.1.3 酶顯色底物。 22 儀器和設(shè)備 22.1 樣品試管，帶有密封蓋，內(nèi)置酶聯(lián)免疫試劑顆粒（21.1.2） 。 GB 5413.372010 12 22.2 移液器（管） ，450 L50 L。 22.3 酶聯(lián)免疫檢測加熱器，405。 22.4 雙流向酶聯(lián)免疫檢測讀數(shù)儀。 23 分析步驟 23.1 加熱器（22.3）預熱到45 5 ，并至少保持15 min。 23.2 液體試樣或乳粉試樣復原后振搖混勻，移取450 L至樣品試管（22.1）中，充分振搖，使其中的酶聯(lián)免疫試劑顆粒（21.1.2）完全溶解。 23.3 將樣品試管（22.1）和酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（21.1）同時置于預熱過的加熱器內(nèi)保溫，保溫時間5 min6 min。使試樣中的黃曲霉毒素M1和酶聯(lián)免疫試劑顆粒中的酶標記黃曲霉毒素M1抗體結(jié)合。 23.4 將樣品試管內(nèi)的全部內(nèi)容物倒入試劑盒（21.1）的樣品池中，樣品將流經(jīng)“結(jié)果顯示窗口”向綠色的激活環(huán)流去。 23.5 當激活環(huán)的綠色開始消失變?yōu)榘咨珪r，立即用力按下激活環(huán)按鍵。 23.6 試劑盒（21.1）繼續(xù)放置在加熱器（22.3）中保溫保持4 min，使顯色反應(yīng)完成。 23.7 將試劑盒從加熱器中取出水平放置，立即進行檢測結(jié)果判讀，結(jié)果判讀應(yīng)在1 min內(nèi)完成。 24 分析結(jié)果的表述 24.1 目測判讀結(jié)果 試樣點的顏色深于質(zhì)控點，或兩者顏色相當，檢測結(jié)果為陰性。 試樣