GB5413.37-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 乳和乳制品中黃曲霉毒素m1的測(cè)定

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.372010中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定 National food safety standard Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products GB 5413.372010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)第一法對(duì)應(yīng)于ISO14501：2007 Milk and milk powder-determination of aflatoxin M1 content -clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography，本標(biāo)準(zhǔn)第一法與ISO14501： 2007的一致性程度為非等效； 本標(biāo)準(zhǔn)第二法和第三法代替GB/T 18980-2003；本標(biāo)準(zhǔn)第四法來(lái)自于NY/T 1664-2008牛乳中黃曲霉毒素M1的快速檢測(cè) 雙流向酶聯(lián)免疫法 。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄A和附錄B為資料性附錄。 GB 5413.372010 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定方法。 標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于乳和乳制品中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定；第二法適用于乳、乳粉，以及低脂乳、脫脂乳、低脂乳粉和脫脂乳粉中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定；第三法適用于乳和乳粉中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定；第四法適用于液態(tài)乳和乳粉中黃曲霉毒素 M1的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 第一法 免疫親和層析凈化 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 3 原理 試樣液體或固體試樣提取液經(jīng)均質(zhì)、超聲提取、離心，取上清液經(jīng)免疫親和柱凈化，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈桑ㄈ?，微孔濾膜過(guò)濾，經(jīng)液相色譜分離，電噴霧離子源離子化，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）方式檢測(cè)。基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 4.1 甲酸（HCOOH） 。 4.2 乙腈 (CH3CN)：色譜純。 4.3 石油醚（CnH2n+2） ：沸程為30 60 。 4.4 三氯甲烷（CHCl3） 。 4.5 氮?dú)猓杭兌?9.9 %。 4.6 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度98%。 4.7 乙腈-水溶液(1+4)：在400 mL水中加入100 mL乙腈。 4.8 乙腈-水溶液(1+9)：在450 mL水中加入50 mL乙腈。 4.9 0.1 % 甲酸水溶液：吸取1 mL 甲酸（4.1） ，用水稀釋至1000 mL。 4.10 乙腈-甲醇溶液（50+50） ：在500 mL乙腈中加入500 mL甲醇。 4.11 氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L） ：稱取2 g氫氧化鈉溶解于100 mL水中。 GB 5413.372010 2 4.12 空白基質(zhì)溶液 分別稱取與待測(cè)樣品基質(zhì)相同的、不含所測(cè)黃曲霉毒素的陰性試樣8份于100 mL燒杯中。以下操作按6.1試液提取和6.2 凈化步驟進(jìn)行。合并所得8份試樣的純化液，用0.22 m 微孔濾膜的一次性濾頭（5.23）過(guò)濾。棄去前0.5 mL濾液，接取少量濾液供液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)。 獲得色譜質(zhì)譜圖后，對(duì)照附錄 A 中的圖 A.2，在相應(yīng)的保留時(shí)間處，應(yīng)不含黃曲霉毒素 M1。剩余濾液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，在-20 電冰箱內(nèi)保存，供配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液使用。 4.13 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品黃曲霉毒素M1 0.10 mg（精確至0.01 mg） ，用三氯甲烷（4.4）溶解定容至10 mL。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.01 mg/mL。溶液轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中后，在-20 電冰箱內(nèi)保存，備用。 4.14 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：吸取黃曲霉毒素M1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.13）10 L于10 mL容量瓶中，用氮?dú)鈱⑷燃淄榇抵两?，空白基質(zhì)溶液（4.12）定容至刻度，所得濃度為10 ng/mL的M1標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再用空白基質(zhì)溶液（4.12）將黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋為0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶電噴霧離子源。 5.2 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T31，柱長(zhǎng)100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm；填料粒徑1.8 m，或同等性能的色譜柱。 5.3 天平：感量為0.001 g和0.00001 g。 5.4 勻漿器。 5.5 超聲波清洗器。 5.6 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.7 50 mL具塞PVC離心管。 5.8 水浴:溫控30 士2 ，50 士2 ，溫度范圍25 60 。 5.9 容量瓶:100 mL。 5.10 玻璃燒杯:250 mL，50 mL。 5.11 帶刻度的磨口玻璃試管:5 mL，10 mL，20 mL。 5.12 移液管:1.0 mL，2.0 mL和50.0 mL。 5.13 玻璃棒。 5.14 10目圓孔篩。 5.15 250 mL分液漏斗。 5.16 100 mL圓底燒瓶。 5.17 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 1給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可，如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 GB 5413.372010 3 5.18 pH計(jì)：精度為0.01。 5.19 250 mL具塞錐形瓶。 5.20 免疫親和柱：針筒式 3 mL。 5.21 10 mL和50 mL一次性注射器。 5.22 固相萃取裝置（帶真空系統(tǒng)） 。 5.23 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜（水相系） 。 6 分析步驟 6.1 試液提取 6.1.1 乳：稱取50 g(精確至0.01 g)混勻的試樣，置于50 mL具塞離心管(5.7)中，在水浴(5.8) 中加熱到3537 。在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。收集全部上清液，供凈化用。 6.1.2 發(fā)酵乳(包括固體狀、 半固體狀和帶果肉型)： 稱取50 g(精確至0.01 g)混勻的試樣， 用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液 （4.11） 在酸度計(jì)(5.18)指示下調(diào)pH至7.4， 在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘下勻漿(5.4)5 min， 以下按 6.1.1 進(jìn)行操作。 6.1.3 乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品：稱取 10 g(精確至0.01 g)試樣，置于250 mL 燒杯中。將50 mL 已預(yù)熱到50 的水加入到乳粉中，用玻璃棒將其混合均勻。如果乳粉仍未完全溶解，將燒杯置于50的水浴(5.8)中放置30 min。溶解后冷卻至20 ，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗滌燒杯，洗滌液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后分別移至兩個(gè)50 mL離心管(5.7)中，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供凈化處理用。 6.1.4 干酪：稱取經(jīng)切細(xì)、過(guò)10目圓孔篩混勻的試樣5g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管(5 .7)中，加2 mL水和30 mL甲醇，在9500 轉(zhuǎn)/分鐘下勻漿5 min，超聲提取30 min，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3） ，振搖2 min，待分層后，將下層移于50 mL燒杯中，棄去石油醚層。重復(fù)用石油醚提取2次。將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL，濃縮液倒入離心管中，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4)（4.7）5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中，加水稀釋至約50 mL，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理。 6.1.5 奶油：稱取5g(精確至0.01 g)試樣，置于50 mL燒杯中，用20 mL石油醚(4.3)將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中。 加20 mL水和30 mL甲醇， 振蕩30 min后， 將全部液體移于分液漏斗中， 待分層后，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（5.17）中減壓濃縮至約5 mL，加水稀釋至約50 mL，供凈化處理。 6.2 凈化 6.2.1 免疫親和柱的準(zhǔn)備 將一次性的50 mL注射器筒與親和柱(5.20)上頂部相串聯(lián)，再將親和柱與固相萃取裝置連接起來(lái)。 注：根據(jù)免疫親和柱的使用說(shuō)明書要求，控制試液的pH值。 6.2.2 試樣的純化 將以上 6.1 試液提取液移至 50 mL 注射器筒(5.21)中，調(diào)節(jié)固相萃取裝置的真空系統(tǒng),控制試樣以 2 mL/分鐘3 mL/分鐘穩(wěn)定的流速過(guò)柱。取下 50 mL 的注射器筒，裝上 10 mL 注射器筒。注射器筒內(nèi)加入水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。脫開真空系統(tǒng)，在親和柱下部放入 10 mL 刻度試管，上部裝上另一個(gè) 10 mL 注射器筒， 加入 4 mL 乙腈(4.2),洗脫黃曲霉毒素 M1， 洗脫液收集在刻度試管中(5.11)中，洗脫時(shí)間不少于 60 秒。然后用氮?dú)饩従彽卦?30 下將洗脫液蒸發(fā)至近干 (如果蒸發(fā)至干，會(huì)損失黃曲霉毒素 M1 )，用乙腈-水溶液（1+9）稀釋至 1 mL。 GB 5413.372010 4 6.3 液相色譜參考條件 流動(dòng)相：A 液，0.1% 甲酸溶液；B 液，乙腈-甲醇溶液（1+1） 。 梯度洗脫：參見(jiàn)附錄A中的表A.1。 流動(dòng)相流動(dòng)速度：0.3 mL/min。 柱溫：35 。 試液溫度：20 。 進(jìn)樣量：10 L。 6.4 質(zhì)譜參考條件 檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），詳見(jiàn)表1中母離子、子離子和碰撞能量。掃描圖參見(jiàn)附錄A中的圖A.1。 表1 離子選擇參數(shù)表 黃曲霉毒素 母離子 定量子離子 碰撞能量 定性子離子 碰撞能量 離子化方式 M1 329.0 273.5 22 259.5 22 ESI+ 離子源控制條件：參見(jiàn)附錄A中的表A.2。 6.5 定性 試樣中黃曲霉毒素 M1色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較， 變化范圍應(yīng)在2.5之內(nèi)。 黃曲霉毒素 M1的定性離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于 3（S/N3） ， 定量離子的重構(gòu)離子色譜峰的信噪比應(yīng)大于等于 10（S/N10） 。 每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，而且同一檢測(cè)批次，對(duì)同一化合物， 樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比， 其允許偏差不超過(guò)表 2 規(guī)定的范圍。 表 2 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差 相對(duì)離子豐度 50 20至 50 10至 20 10 允許相對(duì)偏差 20% 25% 30% 50% 各檢測(cè)目標(biāo)化合物以保留時(shí)間和兩對(duì)離子（特征離子對(duì)/定量離子對(duì)）所對(duì)應(yīng)的 LC-MS/MS色譜峰面積相對(duì)豐度進(jìn)行定性。要求被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間一致（一致的條件是偏差小于 20%） ，同時(shí)要求被測(cè)試樣中目標(biāo)化合物的兩對(duì)離子對(duì)應(yīng) LC-MS/MS 色譜峰面積比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的面積比一致。 6.6 試樣測(cè)定 按照 6.3 和 6.4 確立的條件，測(cè)定試液（6.2）和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.14）中黃曲霉毒素 M1的離子強(qiáng)度，外標(biāo)法定量。色譜圖見(jiàn)附錄 A 的圖 A.2。 色譜參考保留時(shí)間：黃曲霉毒素 M1 3.23 min。 6.7 空白試驗(yàn) 不稱取試樣，按6.5的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾被測(cè)組分的物質(zhì)。 6.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 GB 5413.372010 5 將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.14）由低到高濃度進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。 6.9 定量測(cè)定 待測(cè)樣液中被測(cè)組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)， 超過(guò)線性范圍時(shí)， 則應(yīng)將樣液用空白基質(zhì)溶液稀釋后重新進(jìn)樣分析或減少取樣量，重新按6.1進(jìn)行處理后再進(jìn)樣分析。 7 分析結(jié)果的表述 外標(biāo)法定量，按式（1）計(jì)算黃曲霉毒素M1的殘留量。 mfVAX1=（1） 式中: X試樣中黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每千克（g/kg） ； A試樣中黃曲霉毒素 M1的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL） ； V樣品定容體積，單位毫升（mL）； f樣液稀釋因子； m試樣的稱樣量，單位克（g） 。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的 10 %。 第二法 免疫親和層析凈化高效液相色譜法 9 原理 親和柱內(nèi)含有的黃曲霉毒素 M1特異性單克隆抗體交聯(lián)在固體支持物上，當(dāng)試樣通過(guò)親和柱時(shí)，抗體選擇性的與黃曲霉毒素 M1(抗原)鍵合，形成抗體抗原復(fù)合體。用水洗柱除去柱內(nèi)雜質(zhì)，然后用洗脫劑洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素 M1，收集洗脫液。用帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀測(cè)定洗脫液中黃曲霉毒素 M1含量。 10 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 10.1 免疫親和柱：親和柱的最大容量不小于100 ng黃曲霉毒素M1(相當(dāng)于50 mL濃度為2 g/L的試樣)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液含有4 ng黃曲霉毒素M1(相當(dāng)于50 mL濃度為80 ng/L的試樣)時(shí)回收率不低于80 %。 應(yīng)該定期檢查親和柱的柱效和回收率，對(duì)于每個(gè)批次的親和柱至少檢查一次(見(jiàn)10.1.1和10.1.2)。 10.1.1 柱效檢查 用移液管(11.4)移取 1.0 mL 的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10.5.2)到 20 mL 的錐形試管中(11.9)。用恒流的氮?dú)?10.3)將液體慢慢吹干，然后用 10 mL l0 %的乙腈水溶液(10.2.2)溶解殘?jiān)?，用力搖蕩。 將該溶液加入到 40 mL 的水中，充分混勻，全部通過(guò)免疫親和柱（10.1） 。按說(shuō)明書要求使用免疫親和柱。淋洗免疫親和柱后，洗脫黃曲霉毒素 M1。將洗脫液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用高效液相色譜儀測(cè)定免疫親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1含量。 計(jì)算黃曲霉毒素 M1的回收率，將其結(jié)果與 10.1 中所要求的指標(biāo)進(jìn)行比較。 GB 5413.372010 6 10.1.2 回收率檢查 用移液管(11.4)移取 0.8 mL 0.005 g/mL 的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)工作液(10.5.3)到 10 mL 的水中，充分混勻，全部通過(guò)免疫親和柱。按說(shuō)明書使用免疫親和柱。淋洗免疫親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1。將洗脫液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用高效液相色譜儀測(cè)定免疫親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1含量。計(jì)算黃曲霉毒素 M1的回收率，將其結(jié)果與 10.1 中所要求的指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比。 10.2 乙腈(CH3CN)：色譜純。 10.2.1 25 %乙腈水溶液：將250 mL的乙腈(10.2)與750 mL的水混溶(使用前需要脫氣)。 10.2.2 10 %乙腈水溶液：將100 mL的乙腈(10.2)與900 mL的水混溶(使用前需要脫氣)。 10.3 氮?dú)猓∟2） 。 10.4 三氯甲烷：加入0.5 %1.0 %質(zhì)量比(與三氯甲烷質(zhì)量比)的乙醇進(jìn)行穩(wěn)定。 10.5 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，純度98%。 10.5.1 濃度的校正 黃曲霉毒素 M1三氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 10 g/mL。根據(jù)下面的方法，在最大吸收波段處測(cè)定溶液的吸光度，以確定黃曲霉毒素 M1的實(shí)際濃度。 用分光光度計(jì)（11.11）在 340 nm370 nm 處測(cè)定，扣除三氯甲烷的空白本底，讀取標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。在接近 360 nm 最大吸收波段 max處，測(cè)得吸光度值為 A，根據(jù)式（2）計(jì)算濃度值： 100=MAci(2) 式中： ci黃曲霉毒素 M1實(shí)際濃度，單位為微克每毫升 ( g/mL)； A在max處測(cè)得的吸光度值； M328 g/mol，黃曲霉毒素 M1摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol） ； 19950，溶于三氯甲烷中的黃曲霉毒素 M1的吸光系數(shù)，單位為平方米每摩爾（m2/mol） 。 10.5.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 確定黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度值后（10.5.1） ，繼續(xù)用三氯甲烷將其稀釋為濃度為 0.1 g/mL 的儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液密封后于冰箱中 5 以下避光保存。在此條件下，儲(chǔ)備液可以穩(wěn)定兩個(gè)月。 10.5.3 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)工作液 從冰箱中取出標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.5.2）放置至室溫，移取一定量的儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋制備成工作液。工作液臨用前配制。 黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：用移液管（11.4）準(zhǔn)確移取 1.0 mL 的儲(chǔ)備液（10.5.2）到 20 mL的錐形試管中（11.9） ，用和緩的氮?dú)猓?0.3）將溶液吹干，然后用 20.0 mL10 %的乙腈水溶液（10.2.2）將殘?jiān)匦氯芙猓?0 min 內(nèi)振搖，混勻，配成濃度為 0.005 g/mL 的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)工作液。在用氮?dú)鈱?duì)儲(chǔ)備液吹干的過(guò)程中，一定要仔細(xì)操作，避免因溫度降低太多而出現(xiàn)結(jié)露。 在作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，黃曲霉毒素 M1的進(jìn)樣絕對(duì)含量分別是 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng、0.4 ng。根據(jù)高效液相色譜儀進(jìn)樣環(huán)的容積量，用工作液配置一系列適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋液用 10 %乙腈水溶液（10.2.2） 。 11 儀器和設(shè)備 11.1 一次性注射器：10 mL和50 mL。 11.2 真空系統(tǒng)。 GB 5413.372010 7 11.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速7000 轉(zhuǎn)/分鐘。 11.4 移液管：1.0 mL、2.0 mL和50.0 mL。 11.5 玻璃燒杯：250 mL。 11.6 容量瓶：100 mL。 11.7 水?。簻乜?0 2，50 2 ，溫度范圍361 。 11.8 濾紙：中速定性濾紙。 11.9 帶刻度的磨口錐形玻璃試管：5 mL、10 mL、20 mL。 11.10 高效液相色譜儀 11.10.1 無(wú)脈沖泵：適合恒定體積流量約1 mL/min的泵。 11.10.2 進(jìn)樣系統(tǒng)：具有固定或可變?nèi)莘e的進(jìn)樣環(huán)，進(jìn)樣體積50 L500 L。 11.10.3 反相色譜柱：填充3 m或者5 m的十八烷基硅膠，加有填充反相材料的保護(hù)柱。 11.10.4 熒光檢測(cè)器：具有365 nm激發(fā)波長(zhǎng)、435 nm發(fā)射波長(zhǎng)，在適當(dāng)?shù)纳V條件下能夠測(cè)定0.02 ng的黃曲霉毒素M1(相當(dāng)于5倍噪音)。 11.11 紫外分光光度計(jì)：波長(zhǎng)范圍為200 nm400 nm。 11.12 天平：感量為0.01 g。 12 分析步驟 所有的操作分析均應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。 12.1 試樣制備 12.1.1 乳：將試樣在水?。?1.7）中加熱到3537。用濾紙（11.8）過(guò)濾（根據(jù)情況，可以使用多層濾紙進(jìn)行過(guò)濾） ，或者在7000 轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min。至少收集50 mL試樣，按照12.4繼續(xù)操作。 12.1.2 乳粉：稱取10 g樣品（精確到0.1 g） ，置于250 mL的燒杯（11.5）中。將50 mL已預(yù)熱到50的水多次少量地加入到乳粉中，用攪拌棒將其混合均勻。如果乳粉不能完全溶解，將燒杯在50的水浴（11.7）中放置至少30 min,仔細(xì)混勻。將溶解的乳粉冷卻至20后，移入100 mL容量瓶（11.6）中，用少量的水分次淋洗燒杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。用濾紙（11.8）過(guò)濾乳，或者在7000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15 min。至少收集50 mL的乳試樣，按照12.4繼續(xù)進(jìn)行分析。 12.1.3 發(fā)酵乳：按照“第一法”中6.1.2的前處理方法進(jìn)行。 12.1.4 干酪：按照“第一法”中6.1.4的前處理方法進(jìn)行。 12.1.5 奶油：按照“第一法”中6.1.5的前處理方法進(jìn)行。 12.2 免疫親和柱的準(zhǔn)備 將一次性的 50 mL 注射器筒（11.1）與親和柱（10.1）的頂部相連，再將親和柱與真空系統(tǒng)（11.2）連接起來(lái)。 12.3 試樣的提取與純化 用移液管移取 50 mL 試樣（12.1.1 或 12.1.2）到 50 mL 注射器（11.1）中，調(diào)節(jié)真空系統(tǒng)（11.2） ，控制試樣以 2 mL/min3 mL/min 穩(wěn)定的流速過(guò)柱。 取下 50 mL 的注射器，裝上 10 mL 注射器。注射器內(nèi)加入 10 mL 水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后， GB 5413.372010 8 抽干親和柱。 脫開真空系統(tǒng)，裝上另一個(gè) 10 mL 注射器，加入 4 mL 乙腈(10.2)。緩緩?fù)苿?dòng)注射器栓塞，通過(guò)柱塞控制流速，洗脫黃曲霉毒素 M1，洗脫液收集在錐形管(11.9)中，洗脫時(shí)間不少于 60 s。然后用和緩的氮?dú)?10.3)在 30 下將洗脫液蒸發(fā)至體積為 50 L500 L(如果蒸發(fā)至干， 會(huì)損失黃曲霉毒素 M1)。再用水稀釋 10 倍至最終體積為 Vf(即 500 L5000 L)。 注：如果注入高效液相色譜儀含黃曲霉毒素 M1的樣品，乙腈含量超過(guò) 10，色譜峰變寬。如果水含量超過(guò) 90 ，則對(duì)色譜峰的形狀沒(méi)有影響。 12.4 高效液相色譜分析 12.4.1 色譜條件 色譜柱：C18，長(zhǎng)25 cm，內(nèi)徑4.6 mm； 流動(dòng)相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)； 流速：1 mL/min。 12.4.2 黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)高效液相色譜儀進(jìn)樣環(huán)容積，選擇適當(dāng)進(jìn)樣體積數(shù) Vi，分別注入含有 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng和 0.4 ng 的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)溶液。繪制成峰面積或峰高對(duì)黃曲霉毒素 M1質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 12.4.3 色譜分析 根據(jù)樣品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素 M1的峰高或峰面積值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品洗脫液中所含有的黃曲霉毒素 M1質(zhì)量數(shù)(ng)。 如果樣品洗脫液的黃曲霉毒素 M1的峰面積或峰高值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，用水定容稀釋樣品洗脫液后，重新進(jìn)樣分析。 13 分析結(jié)果的表述 13.1 乳 應(yīng)用式(3)計(jì)算被測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 M1的含量 m。 VVVmifAm=1（3） 式中： m黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每升( g/L)； mA樣品洗脫液黃曲霉毒素 M1的峰面積或峰高從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出的黃曲霉毒素 M1的質(zhì)量，單位為納克(ng)； Vi樣品洗脫液的進(jìn)樣體積，單位為微升(L)； Vf樣品洗脫液的最終體積，單位為微升(L)； V通過(guò)免疫親和柱被測(cè)樣品的體積，單位為毫升(mL)。 式(3)適用于未經(jīng)稀釋的試樣，否則應(yīng)該乘以稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 13.2 乳粉 應(yīng)用式(4)計(jì)算被測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 M1的含量 p。 mVVmifAp=1 (4) GB 5413.372010 9 式中： p黃曲霉毒素 M1的含量，單位為微克每千克(g/kg)； m50mL 樣液(12.3)中所含乳粉質(zhì)量，單位為克(g)。 mA、Vf、Vi的含義與 13.1 中所定義的一樣。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 14 精密度 各實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的精密度總結(jié)于附錄 B 中，這些數(shù)據(jù)不適用于其他的污染水平和被測(cè)樣。 第三法 免疫層析凈化熒光分光度法 15 原理 試樣經(jīng)過(guò)離心、脫脂、過(guò)濾，濾液經(jīng)含有黃曲霉毒素M1特異性單克隆抗體的免疫親和柱層析凈化，黃曲霉毒素M1交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。 此抗體對(duì)黃曲霉毒素M1具有專一性， 當(dāng)樣品通過(guò)親和柱時(shí)，抗體選擇性的與所有存在的黃曲霉毒素M1(抗原)鍵合。用甲醇-水(1+9)將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇-水(8+2)通過(guò)免疫親和柱洗脫，將溴溶液衍生后的洗脫液置于熒光光度計(jì)中測(cè)定黃曲霉毒素M1含量。 16 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 16.1 甲醇(CH3OH):色譜純。 16.2 氯化鈉(NaCl)。 16.3 甲醇-水(1+9):取10 mL甲醇加入90 mL水。 16.4 甲醇-水(8+2):取80 mL甲醇加入20 mL水。 16.5 溴溶液儲(chǔ)備液(0.01 %):稱取適量溴，溶于水后，配成0.01%的儲(chǔ)備液，避光保存。 16.6 溴溶液工作液(0.002 %):取10 mL0.01 %的溴溶液儲(chǔ)備液加入40 mL水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩，F(xiàn)用現(xiàn)配。 16.7 二水硫酸奎寧(C20H24N2O2)2H2SO42H2O。 16.8 硫酸溶液(0.05 mol/L):取2.8 mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000 mL。 16.9 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液:稱取0.340 g 二水硫酸奎寧， 用0.05 mol/L硫酸溶液 （16.8） 溶解并定容至100 mL，此溶液熒光光度計(jì)讀數(shù)相當(dāng)于2.0 g/L黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.05 mol/L硫酸溶液（16.8）熒光光度計(jì)讀數(shù)相當(dāng)于0.0 g/L黃曲霉毒素M1。 17 儀器和設(shè)備 17.1 熒光光度計(jì)。 17.2 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速7000 轉(zhuǎn)/分鐘。 17.3 玻璃纖維濾紙:直徑 11 cm，孔徑1.5 m。 GB 5413.372010 10 17.4 黃曲霉毒素M1免疫親和柱。 17.5 空氣壓力泵。 17.6 玻璃試管:直徑12 mm，長(zhǎng)75 mm，無(wú)熒光特性。 17.7 玻璃注射器：10 mL。 18 分析步驟 18.1 試樣提取 18.1.1 乳：取 50.0 mL試樣，加入1.0 g氯化鈉（16.2），7000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10 min，小心移取用于分析的乳底脫脂層，不要碰觸頂部脂肪層，將脫脂的乳以玻璃纖維濾紙（17.3）過(guò)濾，濾液備用。 18.1.2 乳粉：稱取 5 g 試樣(精確至0.01 g)，用30 60 水將其慢慢溶解，定容至50 mL，加入1.0 g 氯化鈉（16.2），以下按18.2的步驟操作。 18.2 凈化 將免疫親和柱（17.4）連接于10 mL玻璃注射器（17.7）下。準(zhǔn)確移取10.0 mL上述濾液（18.1）注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵（17.5）與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6 mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱（17.4），直至2 mL3 mL空氣通過(guò)柱體。以10 mL甲醇-水(1+9)（16.3）清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL3 mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL(V1)甲醇-水(8十2)（16.4）洗脫液洗脫，流速為1 mL/min2 mL/min，收集全部甲醇-水洗脫液于玻璃試管（17.6）中，備用。 18.3 測(cè)定 18.3.1 熒光光度計(jì)校準(zhǔn) 在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm條件下，以0.05 mol/L的硫酸溶液（16.8）為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為 0.0 g/L； 以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液（16.9）調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值2.0 g/L。 18.3.2 樣液測(cè)定 取上述洗脫液加入1.0 mL (V) 0.002 %溴溶液，1 min后立即于熒光光度計(jì)測(cè)定樣液中黃曲霉毒素M1含量c1。 18.3.3 空白試驗(yàn) 用水代替試樣，按18.118.3 步驟做空白試驗(yàn)。 19 分析結(jié)果的表述 19.1 乳 乳檢測(cè)結(jié)果按式(5)計(jì)算: VVCCX10)(1011=(5) 式中: X1試樣中黃曲霉毒素M1含量，單位為微克每升(g/L)； C1熒光光度計(jì)中讀取的樣液中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升(g/L)； C0熒光光度計(jì)中讀取的空白試驗(yàn)中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升(g/L)； GB 5413.372010 11 V1最終凈化甲醇-水（8+2）洗脫液體積，單位為毫升(mL)； V通過(guò)親和柱試樣體積，單位為毫升(mL)； 10儀器的讀數(shù)系數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。 19.2 乳粉 乳粉檢測(cè)結(jié)果按式(6)計(jì)算: mVVCCX=10)(1022(6) 式中: X2 試樣中黃曲霉毒素M1含量，單位為微克每千克(g/kg)； C2 熒光光度計(jì)中讀取的樣液中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升（g/L)； C0 熒光光度計(jì)中讀取的空白試驗(yàn)中黃曲霉毒素M1的濃度，單位為微克每升（g/L)； Vl 最終凈化甲醇-水(8+2)洗脫液體積，單位為毫升(mL)； V通過(guò)親和柱試樣體積，單位為毫升(mL)； m50 mL試樣中所含乳粉的質(zhì)量，單位為克每毫升(g/mL)； 10儀器的讀數(shù)系數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。 第四法 雙流向酶聯(lián)免疫法 20 原理 利用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，樣品中殘留的黃曲霉毒素M1與定量特異性酶標(biāo)抗體反應(yīng)，多余的游離酶標(biāo)抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，通過(guò)流動(dòng)洗滌，加入酶顯色底物顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比較定性。 21 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水。 21.1 黃曲霉毒素M1雙流向酶聯(lián)免疫試劑盒，2 7 保存。 21.1.1 黃曲霉毒素M1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。 21.1.2 酶聯(lián)免疫試劑顆粒（含特異性酶標(biāo)抗體） 。 21.1.2.1 抗黃曲霉毒素M1抗體。 警告：不應(yīng)破損，否則立即銷毀。 21.1.2.2 酶結(jié)合物。 21.1.3 酶顯色底物。 22 儀器和設(shè)備 22.1 樣品試管，帶有密封蓋，內(nèi)置酶聯(lián)免疫試劑顆粒（21.1.2） 。 GB 5413.372010 12 22.2 移液器（管） ，450 L50 L。 22.3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)加熱器，405。 22.4 雙流向酶聯(lián)免疫檢測(cè)讀數(shù)儀。 23 分析步驟 23.1 加熱器（22.3）預(yù)熱到45 5 ，并至少保持15 min。 23.2 液體試樣或乳粉試樣復(fù)原后振搖混勻，移取450 L至樣品試管（22.1）中，充分振搖，使其中的酶聯(lián)免疫試劑顆粒（21.1.2）完全溶解。 23.3 將樣品試管（22.1）和酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（21.1）同時(shí)置于預(yù)熱過(guò)的加熱器內(nèi)保溫，保溫時(shí)間5 min6 min。使試樣中的黃曲霉毒素M1和酶聯(lián)免疫試劑顆粒中的酶標(biāo)記黃曲霉毒素M1抗體結(jié)合。 23.4 將樣品試管內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物倒入試劑盒（21.1）的樣品池中，樣品將流經(jīng)“結(jié)果顯示窗口”向綠色的激活環(huán)流去。 23.5 當(dāng)激活環(huán)的綠色開始消失變?yōu)榘咨珪r(shí)，立即用力按下激活環(huán)按鍵。 23.6 試劑盒（21.1）繼續(xù)放置在加熱器（22.3）中保溫保持4 min，使顯色反應(yīng)完成。 23.7 將試劑盒從加熱器中取出水平放置，立即進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判讀，結(jié)果判讀應(yīng)在1 min內(nèi)完成。 24 分析結(jié)果的表述 24.1 目測(cè)判讀結(jié)果 試樣點(diǎn)的顏色深于質(zhì)控點(diǎn)，或兩者顏色相當(dāng)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。 試樣