超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定.ppt

超氧化物歧化酶(SOD) 活性測(cè)定,(NBT法),一、測(cè)定意義 二、目的要求 三、原理 四、儀器設(shè)備 五、試劑配制 六、植物材料 七、操作步驟 八、結(jié)果計(jì)算 九、注意事項(xiàng) 十、思考題,一、意義：,細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，自由基水平很低，不會(huì)傷害細(xì)胞。,植物正常情況下,植物逆境脅迫下,O-.2、H2O2、OH的產(chǎn)量增加； SOD、CAT、POD活性降低； VtE、VtC、CAR、GSH含量降低； 從而傷害細(xì)胞。,植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡被打破,什么叫逆境？,逆境是指對(duì)植物生存生長(zhǎng)不利的各種環(huán)境因素的總稱.,逆境的種類?,為什么要測(cè)定完全液和缺素苗的SOD活性？,二、目的要求：,1.了解SOD活力測(cè)定的實(shí)踐意義； 2.掌握SOD測(cè)定的原理及操作要點(diǎn)； 3.比較完全液溶液和缺素溶液培養(yǎng)的 玉米苗葉片SOD活性的差異。,三、原理：,三、原理：,依據(jù)SOD能抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2.-，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2.-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。,四、儀器設(shè)備,研缽；玻璃試管; 40W熒光燈; 移液管等。,五、試劑配制,1、提取介質(zhì)50mmol/L(pH7.0)磷酸緩沖液。 2、反應(yīng)介質(zhì)50mmol/L(pH7.8)磷酸緩沖液, 內(nèi)含77.12mol/L硝基四唑藍(lán), 0.1mmol/L EDTA, 13.37mmol/L蛋氨酸。 3、80.2mol/L核黃素溶液: 用含有0.1mmol/L EDTA的50mmol/L(pH7.8)的磷酸緩沖液配制。 SOD反應(yīng)混合液,3.9ml反應(yīng)介質(zhì),0.1ml 80.2mol/L核黃素溶液,六、植物材料:,玉米葉片: 完全液培養(yǎng)苗 缺素液培養(yǎng)苗,七、操作步驟,將玉米葉片剪細(xì) 混合均勻稱0.2g (用保鮮膜包好放低溫 冰箱預(yù)凍),研磨成勻漿再加入3ml緩沖液,研磨均勻后, 將勻漿液倒入聚乙烯離心管中低溫(04)下、4800rpm離心10min上清液即為酶液，將上清液倒入小青霉瓶，低溫下貯存，供SOD活性測(cè)定。,1、酶液的提?。?加入2ml冰冷的 0.05mol/LpH7.0 磷酸緩沖液及少量的石英砂,研缽, 2.SOD活性測(cè)定： 取6支試管, 編號(hào), 按下表加入試劑。將1號(hào)管用黑紙袋套上, 與其它試管一起放熒光燈下, 光強(qiáng)3000Lx照光10min, 到時(shí)間后關(guān)燈, 用黑布罩上試管(如室內(nèi)光線不強(qiáng), 不罩黑布也可), 以1號(hào)試管溶液為參比, 測(cè)定樣品在560nm處的吸光度。不加酶的2號(hào)試管溶液顏色最深; 加入酶的由于SOD抑制了硝基四唑藍(lán)的光還原,顏色變淺。,2、活性測(cè)定： 取6支干燥的、玻璃質(zhì)量一致的普通試管，按下表順序加入試劑,式中：Ack為2號(hào)對(duì)照管溶液在560nm處的吸光度值; AE為樣品測(cè)定管溶液在560nm處的吸光值; V為酶液總體積（ml)； W為提取酶液的植物材料的鮮重（g)； Vt為測(cè)定時(shí)酶液的用量(ml)。,八、結(jié)果計(jì)算：,（Ack-AE)V SOD活性(U/g鮮重) AckWVt50,一個(gè)酶活單位定義為將硝基四唑藍(lán)的還原抑制到對(duì)照一半(50)時(shí)所需的酶量。,九、注意事項(xiàng): 1.所用試管的玻璃質(zhì)量要一樣。包括厚度、直徑、質(zhì)量等。 2.照光條件要一致。照光時(shí)試管放的高度、背景等。 3.要多做對(duì)照消除日光燈管的光質(zhì)差異。 4. 植物組織中的酚類物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾，對(duì)酚類含量高的材料提取酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5.結(jié)果計(jì)算時(shí)要用相鄰對(duì)照管代入公式計(jì)算。,十、思考題: 1.在SOD活性測(cè)定中為什么設(shè)照光和暗中兩個(gè)對(duì)照管。 2.影響本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的主要因素是什么？應(yīng)如何克服？,1.下次實(shí)驗(yàn)：改良半葉法測(cè)定植物光合速率 2. 請(qǐng)按植物生理生化實(shí)驗(yàn)B補(bǔ)充材料認(rèn)真書寫預(yù)習(xí)報(bào)告！ 3. 實(shí)