葉綠體色素的提取理化性質(zhì)與含量測(cè)定.ppt

實(shí)驗(yàn) 葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)與含量測(cè)定,提取葉綠體色素 分析葉綠素的物理、化學(xué)性質(zhì) 測(cè)定葉綠素的含量 提取和測(cè)定植物組織中的光合色素是研究光合作用機(jī)理的重要技術(shù)手段。,1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x,2.1 用含水的有機(jī)溶劑提取葉綠素,2. 實(shí)驗(yàn)原理,親水的“頭部”：鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，帶正電性，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電性，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。 親脂的“尾巴”：葉綠醇是由四個(gè)異戊二烯單位組成的雙萜，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。,純的有機(jī)溶劑不能打破葉綠體色素與蛋白質(zhì)的聯(lián)系，所以必須用能與水混溶的有機(jī)溶劑并有少量水存在時(shí)，才能將葉綠體色素提取出來(lái)。,80%丙酮 95%乙醇 丙酮:乙醇:水(4.5:4.5:1),2.2 葉綠素的物理性質(zhì),1）葉綠素的吸收光譜,紅光區(qū)：640660 nm 籃紫光區(qū)：430450 nm,胡蘿卜素和葉黃素：400500 nm,不用藍(lán)光區(qū)測(cè)葉綠素含量。,2）熒光現(xiàn)象,葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色的現(xiàn)象。,2.3 葉綠素的化學(xué)性質(zhì),葉綠素是葉綠酸的酯（葉綠酸是雙羧酸，其中一個(gè)羧基被甲醇酯化，另一個(gè)被葉綠醇酯化）。 葉綠素可以與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，用此法可將葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。,1）皂化反應(yīng),皂化分層,葉綠酸的鹽形成以后，因分子極性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能進(jìn)入苯層； 而類(lèi)胡蘿卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中； 一部分苯分散在水中形成乳膠體，出現(xiàn)一層乳白色的溶液。,低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白色絮狀物，溶液渾濁，且不分層。,2）取代反應(yīng),卟啉環(huán)中的Mg處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等離子取代。 稀酸：葉綠素溶液與稀酸作用，Mg可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，去鎂葉綠素遇Cu2+則成為深綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞（常用醋酸銅處理來(lái)保存綠色植物標(biāo)本）。 濃酸：葉綠素溶液與濃酸作用，Mg被H+取代，且生成的去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。,1）吸收光譜 紅光區(qū)：640660 nm；籃紫光區(qū)：430450 nm 。 2）熒光現(xiàn)象 葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色。 3）皂化反應(yīng) 葉綠素是葉綠酸的酯，可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，用此法可將葉綠素與類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。 4）取代反應(yīng) 在稀酸中，葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇Cu2+則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞。在濃酸中，葉綠素中的Mg被H+取代，且生成的去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。 5）葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強(qiáng)光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類(lèi)胡蘿卜素則較穩(wěn)定。,葉綠素的理化性質(zhì),1）葉綠素a、b分別在665nm和649nm波長(zhǎng)處（95%乙醇提?。┯凶畲蟮奈辗?，同時(shí)在該波長(zhǎng)處葉綠素a，b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)Lambert-Beer定律，列出以下關(guān)系式： Ca=13.95A665 6.88 A649 Cb=24.96 A649 7.32 A665 CT =Ca + Cb= 18.08 A649 + 6.63A665 A665和A649為葉綠素溶液在波長(zhǎng)665 nm和649 nm時(shí)的吸光度 Ca、Cb、CT分別為葉綠素a 、 b及總的濃度，以mgL-1為單位 2）葉綠素a 、b在652 nm波長(zhǎng)處有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），在此波長(zhǎng)下測(cè)定葉綠素溶液的吸光度，也可計(jì)算出葉綠素a 、b的總濃度。 CT=（A6521000）34.5 3）葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度提取液體積稀釋倍數(shù)/樣品鮮重,2.4 葉綠素含量的計(jì)算,3. 材料、儀器設(shè)備與試劑,材料：菠菜葉片 儀器：試管、容量瓶、研缽、分光光度計(jì)、水浴鍋，等。 試劑：石英砂、碳酸鎂、95乙醇、20%NaOH-甲醇、 苯、 36%乙酸、醋酸銅、濃鹽酸,葉綠體色素提取 稱(chēng)取新鮮去大葉脈的菠菜葉片3g，剪碎放入研缽中， 加少量石英砂和碳酸鎂及5ml 95乙醇，研成均漿，過(guò)濾入25ml 容量瓶，分別用5ml 95乙醇沖洗研缽3次，沖洗液同樣過(guò)濾，收集濾液，倒入容量瓶中，最后用95乙醇定容至25ml，放入暗處備用。 2. 葉綠素的熒光現(xiàn)象 取葉綠素提取液2ml放入試管中，在直射光下觀察溶液的透射光及反射光的顏色有何不同？ （結(jié)果與分析1） 3. 光對(duì)葉綠體色素的破壞作用 取兩支試管，各加入葉綠體色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗處，12 h后觀察兩管溶液顏色有何變化？（結(jié)果與分析2）,4. 實(shí)驗(yàn)步驟,4. 葉綠素的皂化作用 3ml提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（搖勻） 冷卻 + 3ml苯（搖勻） + 3ml蒸餾水（逐滴加，搖勻） 靜置，觀察分層現(xiàn)象。 下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。 對(duì)照：另取3ml 葉綠體色素提取液，加入2ml 苯和2ml 蒸餾水觀察與皂化的葉綠素有何不同？ （結(jié)果與分析3）,5. H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代作用 1）吸取葉綠體色素提取液2ml放入試管中，逐滴加入36%乙酸數(shù)滴，搖勻，觀察溶液顏色的變化。 （結(jié)果與分析4.1） 2）當(dāng)溶液變褐色后，傾出一半于另一試管中，投入幾粒醋酸銅粉，水浴加熱，觀察溶液顏色變化，與未加醋酸銅（同時(shí)加熱）的一管相比較。（結(jié)果與分析4.2） 3）吸取葉綠體色素提取液2ml放入試管中，逐滴加入濃鹽酸，觀察顏色變化。 （結(jié)果與分析4.3）,6. 葉綠體色素含量測(cè)定 吸取葉綠體色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)665nm、649nm、652nm下測(cè)定吸光度，并分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。 最后，根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量： 葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度稀釋倍數(shù)提取液體積 /樣品鮮重 比較兩種方法所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 （結(jié)果與分析5）,5. 結(jié)果與分析,詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)步驟（結(jié)果與分析1-6）,6. 注意事項(xiàng),1）為了避免葉綠素的光分解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間應(yīng)盡量短些，以不超過(guò)2分鐘為宜。 2）葉綠體色素提取液不能渾濁，否則應(yīng)重新過(guò)濾。 3）分光光度計(jì)的正確使用。,1）用不含水的有機(jī)溶劑提取植物材料特別是干材料的葉綠體色素往往效果不佳，原因何在？ 2）研磨提取葉綠素時(shí)加入MgCO3，有什么作用？ 3）葉綠素a、葉綠素b在藍(lán)光區(qū)也有吸收峰，能否用這一吸收峰波長(zhǎng)進(jìn)行葉綠素a、葉綠素b的定量分析？為什么？,7. 思考題,加入少許碳酸鈣的目的是為了防止在研磨過(guò)