腺病毒載體在腫瘤治療中的應(yīng)用.ppt

優(yōu)秀精品課件文檔資料,2,條件增殖腺病毒在腫瘤 治療中的策略,條件增殖腺病毒在腫瘤 治療中的策略,微生物教研室 李曉霞,3,內(nèi) 容,基因治療 分類 主要病毒載體系統(tǒng) 腺病毒載體在腫瘤治療中的策略 條件增殖腺病毒 現(xiàn)狀及策略,基因治療及分類,5,Gene-targeted therapy，以基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療，將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入人體組織或細(xì)胞所進(jìn)行的疾病的治療,基因治療,6,歷史與回顧,1980年有人提出用磷酸鈣介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移來治療地中海貧血。離體基因治療 ex vivo 80年代初建立逆轉(zhuǎn)錄病毒體系為基因治療提供高效率的轉(zhuǎn)移載體。 1989年5月22日Rosenberg首次將外源基因-新霉素抗性基因用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中。,7,歷史與回顧,Anderson于1990年9月4日第一次用于人類疾病的基因治療，兩例由于腺苷脫氨酶缺失導(dǎo)致的免疫缺陷的女孩經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該酶基因?qū)牍撬瓒@救，并且存活至今。 2004 年1月，深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司將世界上第一個(gè)基因治療產(chǎn)品重組人p53 抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市場，這是全球基因治療產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的里程碑,8,基因治療分類,根據(jù)給藥途徑和方法 離體基因治療 ex vivo 原位基因治療 in situ 體內(nèi)基因治療 in vivo,9,基因治療分類,離體基因治療 ex vivo將目的基因在體外導(dǎo)入自體或異體來源的腫瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞，再將這些修飾過的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)入體內(nèi)。 原位基因治療 in situ將目的基因載體直接注射或?qū)塍w內(nèi)的腫瘤組織，進(jìn)行局部治療，這也是最主要的方法。 體內(nèi)基因治療 in vivo將目的基因載體注射到血液系統(tǒng)進(jìn)行全身治療。,10,基因治療分類,根據(jù)基因?qū)氲姆椒?裸露DNA直接注射注射gene gun 脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)化體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化 受體介導(dǎo)的基因?qū)氩《据d體,主要病毒載體系統(tǒng),12,常用的病毒載體的特點(diǎn),13,因該病毒最初來自腺體，故命名為腺病毒(Adenovirus)。 根據(jù)宿主可分鳥腺病毒屬和哺乳類腺病毒。 目前，把人腺病毒的46個(gè)血清型分為A-F 6個(gè)組： A-E組：各型病毒均能在人的組織細(xì)胞 (如腎細(xì)胞) 常規(guī)培養(yǎng)中增殖，稱為普通腺病毒； F組（40和41型）：是從糞便中發(fā)現(xiàn)，用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)不能增殖的腺病毒，稱為腸道腺病毒。,腺病毒,14,基因治療中常用的基因載體 C亞群:2型及5型腺病毒 增殖能力非常強(qiáng)，滴度通常可以達(dá)到109pfu 遺傳背景和生化結(jié)構(gòu)清楚,腺病毒,球形，無包膜，直徑70-80nm。,二十面體病毒殼體,17,腺病毒,殼體含有三種主要的蛋白：六鄰體（II），五鄰體基底（III）和纖突（IV），還有多種其他的輔助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2,18,纖突結(jié)構(gòu)域CAR (coxsackie adenovirus receptor) 五鄰體基質(zhì)中精氨酸甘氨酸天冬氨酸基序 （Arg-Gly-Asp , RGD）細(xì)胞整合素,19,腺病毒,線性雙鏈DNA,基因組36kb 早期和后期轉(zhuǎn)錄單元 前者有E1a、E1b、E2、E3、E4和兩個(gè)延遲型早期單元和a2，編碼病毒的調(diào)節(jié)蛋白 后者有L1、L2、L3、L4、L5 五個(gè)區(qū)，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,20,腺病毒載體構(gòu)建,在人腺病毒C亞群的Ad2 和Ad5 基礎(chǔ)上構(gòu)建 E1區(qū)為病毒復(fù)制必需區(qū)，缺失則成為復(fù)制缺陷型載體 E3區(qū)是病毒復(fù)制非必需區(qū)，用于外源基因的插入,21,腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn),腺病毒粒子相對穩(wěn)定,病毒基因組重排頻率低,外源基因片段插入片段在病毒復(fù)制幾個(gè)周期后仍可保持不變,易于用重組DNA技術(shù)操作; 安全性較好,腺病毒無需整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中,目的基因在宿主細(xì)胞基因組外游離狀態(tài)下表達(dá),整合突變致癌可能性小,基因毒性低; 腺病毒基因組較大(36 kb) ,絕大多數(shù)基因組(約35 kb)均能被外源基因取代,插入大片段外源性基因的潛力大; 有較大的宿主范圍,可以感染肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種人體細(xì)胞,對于受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格; 腺病毒載體容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中,并有效表達(dá)成活性蛋白。,22,第一代腺病毒載體,去除了El/E3基因表達(dá)盒,可以插入長達(dá)615kb的外源DNA。去除E1區(qū)還阻止了依賴E1區(qū)和E2區(qū)功能蛋白的轉(zhuǎn)錄與隨后病毒DNA的復(fù)制及病毒外殼蛋白的產(chǎn)生。E1區(qū)缺失的腺病毒在能夠反式提供E1區(qū)基因蛋白的細(xì)胞中得到增殖。,23,第二代腺病毒載體,在E1、E3缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除了E2區(qū)和(或) E4區(qū),減弱病毒蛋白的表達(dá) 用于鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥的I期臨床實(shí)驗(yàn)。,24,第三代腺病毒載體,通過對無感染能力的腺病毒顆粒的觀察,發(fā)現(xiàn)無感染能力腺病毒顆粒的基因組都含有腺病毒基因組左端的一段序列即包裝信號(hào)。因此設(shè)想保留兩端TR ( Terminal Repeats)及包裝信號(hào)共約500bp 的順式作用元件,去除腺病毒基因組中全部編碼序列(反式作用元件) ,其它功能由輔助病毒提供,這樣的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體即所謂空殼載體（gutless adenovirus）。,腺病毒載體在腫瘤治療中的策略 條件增殖腺病毒,26,條件增殖腺病毒,通過基因工程的方法使病毒特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制來殺死并裂解腫瘤細(xì)胞，從中釋放出來的病毒又可以進(jìn)一步感染周圍的腫瘤細(xì)胞，這類病毒被稱為條件增殖腺病毒（conditionally replicative adenovirus , CRADs）或溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus）。,27,CRADs 的分類,改變病毒的基因使其可以在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，而在正常細(xì)胞中復(fù)制能力降低，稱為I型CRADs。 E1B基因 dl1520 (美國ONYX公司)5型腺病毒，缺失了E1B區(qū)編碼55kd蛋白的序列，該蛋白可通過結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的p53使其功能受到阻滯。 頭頸部腫瘤和卵巢癌的治療進(jìn)入一期和二期臨床試驗(yàn)。 E1A 基因 與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白R(shí)b 結(jié)合，克服其對細(xì)胞周期的抑制作用，使細(xì)胞周期由G1 期過渡到S 期，病毒大量復(fù)制 腺病毒突變株Ad5-24 和dl922-947的E1A 基因在第2 個(gè)保守區(qū)（CR2）缺失24個(gè)堿基，,28,表 1 型CRAd的種類,29,利用腫瘤特異性啟動(dòng)子（tumor specific promoter, TSP）控制病毒復(fù)制相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)，稱為型CRAD。 這類病毒利用腫瘤特異性啟動(dòng)子，使其控制腺病毒復(fù)制必需基因（E1A及E1B），使這些必需基因只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性增殖目的。,30,表 型CRAd中的TSP,31,雙啟動(dòng)子 分別調(diào)控病毒復(fù)制所必需的不同基因。以PSA啟動(dòng)子調(diào)控Ad5的E1A，以hK2（human kallikrein 2）的啟動(dòng)子來調(diào)控E1B的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對前列腺癌的雙重調(diào)控 雜合啟動(dòng)子 由hTERT啟動(dòng)子和CMV最小啟動(dòng)子組成的雜合啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒E1a區(qū)基因表達(dá),32,提高治療效果的策略,通過改變腺病毒的嗜性增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性 構(gòu)建雙銜接分子 該分子可同時(shí)與病毒外殼和宿主細(xì)胞結(jié)合，從而增強(qiáng)腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性 病毒抗體：腺病毒纖突、五鄰體基質(zhì)和六鄰體殼粒 配體：如葉酸酯、基本的成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor, FGF2） 抗體：如表皮生長因子受體的抗體（anti-epidermal growth factor receptor , anti-EGFR）、表皮細(xì)胞粘附素抗體（ anti-epithelial cellular adhesion molecule , anti-EpCAM）,33,基因工程方法改變腺病毒的嗜性 腺病毒5型，暴露于纖突蛋白之外的HI 環(huán)結(jié)構(gòu)備受重視，它可以允許更多得氨基酸片段的插入，約100個(gè)，如RGD-4C肽 嵌合的Ad5和Ad3纖突蛋白結(jié)構(gòu)域 能高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞； Ad5/3嵌合衣殼能在一定程度上避免體內(nèi)早已存在的Ad5抗體對腺病毒的中和作用,34,提高治療效果的策略,腫瘤特異性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平控制外源基因在特定的組織細(xì)胞中表達(dá) CRAds中插入外源基因，將CRAds的溶瘤治療與基因治療相結(jié)合，使其既有對腫瘤的直接殺傷作用，又可以把外源性的治療基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)并大量、持續(xù)的表達(dá)，從而達(dá)到溶瘤-基因治療的雙重目的，這種病毒又被稱為“武裝后的條件增殖腺病毒”（armed CRAds）。,35,插入的外源基因 自殺基因如胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶脫氨酶（CD）基因 免疫調(diào)節(jié)因子TNF、IL-2及腫瘤抑制基因P53 報(bào)告基因編碼熒光蛋白或其他放射性標(biāo)記蛋白,36,目前面臨的問題及展望,由于人體免疫系統(tǒng)的干涉，靜脈注射的病毒往往被免疫系統(tǒng)排除殆盡； 腺病毒在實(shí)體瘤中的擴(kuò)散受到限制，這與腫瘤大小、腫瘤中正常細(xì)胞比例偏高（某些腫瘤中達(dá)50%）、腫