Obatoclax 誘導腺樣囊性癌細胞自噬與凋亡【推薦論文】 .doc

精品論文obatoclax 誘導腺樣囊性癌細胞自噬與凋亡的研究梁立中，馬犇，梁玉潔，蘇宇雄，廖貴清5（中山大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，廣州 510055）摘要：目的 唾液腺腺樣囊性癌是唾液腺中第二常見的惡性腫瘤，其細胞內過表達 bcl-2 和 mcl-1 能夠抑制凋亡，降低治療效果。本研究旨在探討 bcl-2 拮抗劑：obatoclax 在唾液腺腺 樣囊性癌細胞中誘導自噬與凋亡的關系。方法 通過 western blot 和透射電鏡檢測 obatoclax 刺激后 acc-m 細胞自噬水平的變化，然后通過藥物（3-ma 和 cq）抑制細胞內自噬后，10使用 mtt 法觀察 acc-m 細胞活力以及 western blot 檢測 caspase-3 裂解情況。結果 western blot 和透射電鏡結果顯示 obatoclax 能促進 lc3-i 向 lc3-ii 轉化，細胞內部出現大量自噬體 結構。藥物阻斷 obatoclax 誘導的自噬后，其細胞毒性明顯增加，并且促進 caspase-3 裂解，最終導致細胞凋亡。結論 本研究證明 obatoclax 能夠在人唾液腺腺樣囊性癌 acc-m 細胞中誘導自噬，并且證實其誘導的自噬具有抑制凋亡的作用。15關鍵詞：腫瘤學；自噬；凋亡；腺樣囊性癌；obatoclax中圖分類號：r739.87a study of autophagy and apoptosis induced by obatoclax in adenoid cystic carcinoma cells20liang lizhong, ma ben, liang yujie, su yuxiong, liao guiqing(department of oral and maxillofacial surgery, guanghua school of stomatology, sun yat-senuniversity, guangzhou 510055)abstract: objective salivary adenoid cystic carcinoma (acc) of the salivary glands is the secondmost common malignancy in salivary gland. however, over-expression of bcl-2 and mcl-1 in the25acc cells leads to inhibition of apoptosis, which reduces the anti-tumor effect of the treatments.this study was designed to study the relationship between autophagy and apoptosis induced by thebcl-2 antagonists (obatoclax) in salivary adenoid cystic carcinoma. method the transmission electron microscopy was used to detect the autophagy level in acc-m cells under obatoclax stimulation. when 3-ma or cq inhibited obatoclax-mediated autophagy, acc-m cells vitality30was examined by mtt and the cleavage of caspase-3 was detected by western blot. resultswestern blot and transmission electron microscopy results showed that obatoclax promoted autophagy in acc-m cells. pharmacologically inhibiting obatoclax-induced autophagy significantly increased cytotoxicity and promoted caspase-3 cleavage, and eventually leaded to apoptosis. conclusion this study provided the evident that obatoclax induced autophagy in35adenoid cystic carcinoma cells, and confirmed that obatoclax -induced autophagy has a role in inhibiting apoptosis.keywords: oncology; autophagy; apoptosis; adenoid cystic carcinoma; obatoclax0引言40涎腺腺樣囊性癌（acc）占涎腺惡性腫瘤的 7.5-10.0，約占頭頸部惡性腫瘤的 3-5。 手術和手術后的放射治療是治療腺樣囊性癌的主要手段。然而，遠處轉移到肺部，骨和其他 軟組織仍然發(fā)生在約 40-60的患者身上1，是治療失敗的主要原因之一。對于防止遠處轉移化療是必要的，但腺樣囊性癌對現有化療或分子靶向治療不敏感。有基金項目：中山大學醫(yī)科教育部博士點基金(20090171120105)；國家自然科學基金(30901682) 作者簡介：梁立中，(1983-)，男，博士在讀，主要研究方向：唾液腺腫瘤發(fā)生發(fā)展機制。 通信聯(lián)系人：蘇宇雄，(1977-)，男，副教授，主要研究方向：唾液腺腫瘤發(fā)生發(fā)展機制。e-mail:- 6 -報道 bcl-2 和 mcl-1 在 acc 組織中高表達2，這些抗凋亡分子的高表達可能是導致耐藥原因45之一。因此，有必要更好地了解 acc 的發(fā)病的分子機制，為治療提供良好的靶點。 自噬是一種進化上高度保守的氨基酸和能量回收過程，在這過程中，細胞質和細胞器在溶酶體內被降解3。當細胞饑餓或在其他應激條件下，自噬基因如 beclin-1，將被激活，并 啟動自噬過程而產生 atp。除了維持細胞的生存，過度的自噬也可導致細胞死亡，而被稱 為 ii 型程序性細胞死亡。50文獻報道 bcl-2 和 beclin 1 同時調節(jié)細胞自噬和凋亡4。換句話說，bcl-2 和 beclin 1 復合體，在一定程度上決定細胞的命運。我們前期的研究發(fā)現， beclin 1 高表達的涎腺腺 樣囊性癌患者預后比較好。但是，bcl-2 和 beclin-1 復合物在調節(jié) acc 細胞死亡中所起的作 用仍缺乏研究。obatoclax 是一個泛 bcl-2 家族抑制劑，能夠分離 bcl-2 和 bh3-only 蛋白，如 bax 和55bak 之間的連接，激活線粒體途徑的凋亡。此外，研究發(fā)現，obatoclax 能夠將 beclin 1 從 beclin 1 與 bcl-2 復合體中釋放出來，并誘導自噬甚至自噬性細胞死亡5。因此，本研究的 目的是檢測 obatoclax 是否能夠誘導 acc 細胞發(fā)生自噬，以及自噬與凋亡的關系。1材料與方法1.1 試劑和抗體60gx15-070（obatoclax）來自 selleck 公司。3-甲基腺嘌呤（3-ma）購自 sigma-aldrich 公司。 lc3b 和剪切 caspase-3 的抗體來自 cell signaling technology 公司。兔抗人 beclin 1 和兔抗人 gapdh 多克隆抗體購自 santa cruz biotechnology 公司。山羊抗兔多克隆抗體從康 為世紀公司購買。1.2 細胞培養(yǎng)65人涎腺腺樣囊性癌的細胞株 acc-m 由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院，口腔頜 面外科饋贈。acc-m 細胞在含 10胎牛血清（invitrogen 公司），以及 100 u / ml 青霉素/ 鏈霉素（invitrogen 公司）的 rpmi 1640（invitrogen 公司）培養(yǎng)基內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37，5co2。1.3 細胞活力檢測70mtt 用于檢測存活的細胞數目。經過處理后的培養(yǎng)基中加入 20l/孔 mtt（20,10,5）， 然后在 37下孵育 4h，將 mtt 的結晶溶解在每孔 150ldmso 中。最后，酶標儀（tecan 公司）在 490nm 波長中讀取吸光度，計算細胞生長的 50抑制濃度（ic50）。1.4 western blot 檢測蛋白提?。禾幚磉^后細胞用 pbs 沖洗 3 次，加入蛋白裂解液（ripa:pmsf=99:1）（碧75云天公司）4冰箱靜置 10min，冰上刮取細胞，收集到 ep 管內，放置-80冰箱 30min 后 冰上自然融解，4下 12000rpm 離心 15min 后吸取上清，分裝保存于-80。蛋白定量及變 性：用 bca 蛋白定量試劑盒（碧云天公司）檢查各樣本蛋白質濃度。將各蛋白樣本按照說 明書加入上樣緩沖液及 reducing agent（fermentas 公司），pcr 儀 99變性 10min 后立即置 于冰上保存。sds-page 電泳?？偟鞍子?12%（lc3-i、lc3-ii 和 cleave caspase-3） 及 10%80（beclin-1）分離膠中電泳，60v30min 后轉 100v1h，在 100v 下 1.5h 將凝膠內蛋白轉移至859095100pvdf 膜(roch)上。將膜放在含 5%脫脂奶粉的 tbst 緩沖液中室溫孵育 1 小時以封閉膜上的非特異性結合位點。然后與一抗1:500 多克隆兔抗人 lc3b 抗體和 1:1000 多克隆兔抗人 beclin-1 抗體，1:250 兔抗人多克隆抗 cleave caspase-3 抗體 4搖床震蕩過夜。反應后用 tbst 緩沖液洗膜 3 次，加入 1:1000 羊抗兔辣根過氧化物酶標志的二抗（康為世紀），在室溫孵 育 1 小時。采用增強型 ecl 發(fā)光試劑盒定量檢測 lc3-i、lc3-ii、beclin-1 和 cleave caspase-3 的表達情況， 本實驗以 gapdh 作為內參。1.5 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡檢測在 acc-m 細胞內自噬體。經過處理的細胞用胰蛋白酶消化，并在37下用含 4的多聚甲醛和 2.5戊二醛及 0.1m 的二甲胂酸鈉緩沖液中固定 4h，樣品經 過二甲砷酸緩沖液洗滌后，再次在 1四氧化鋨固定 4-6h，然后在乙醇中脫水，嵌入在樹脂 中，并切成超薄切片。最后使用透射型電子顯微鏡（菲利普斯 cm-10）進行觀察。2結果2.1 obatoclax 在 acc-m 細胞誘導自噬自噬被激活時，lc3-i 脂化形成 lc3-ii，定位于自噬體膜上。obatoclax 處理后的 acc-m 細胞中 lc3-i 向 lc3-ii 的轉換，并且具有濃度依賴性（圖 1a）和時間依賴性（圖 1b）。 如圖 2 所示透射電子顯微鏡下發(fā)現 obatoclax 處理的細胞（圖 2c, d）中的自噬結構比對照 細胞（圖 2a, b）明顯增多。我們還發(fā)現，細胞中線粒體的腫脹。圖 1 obatoclax 處理后的 acc-m 細胞中 lc3-i 向 lc3-ii 的轉換，a 表示隨濃度增加 lc3-i 向 lc3-ii 的轉 換增多；b 表示隨時間增加 lc3-i 向 lc3-ii 的轉換增多。fig. 1 obatoclax induced time-dependent and concentration-dependent accumulation of lc3-ii in acc-m cells，athe conversion from lc3-i to lc3-ii increased as the concentration of obatoclax increased. b the conversion from lc3-i to lc3-ii increased with time.105110115120圖 2a、b 顯示正常 acc-m 細胞在透射電鏡下的形態(tài)，c、d 顯示在透射電鏡下 obatoclax 處理 48h 后大量 自噬體結構形成fig. 2 a, b show normal acc-m cell morphology under the transmission electron microscope, c, d show a large number of autophagosomes formation after obatoclax treated for 48h under the transmission electron microscope2.2 藥物抑制 obatoclax 誘導的自噬促進細胞凋亡本研究使用兩種公認的自噬抑制劑：3 - 甲基腺嘌呤（3-ma）和氯喹（cq）。 3-ma 抑制能夠 pi3 激酶，而型 pi3k 是誘導自噬的主要分子通路。而 cq 能夠抑制自噬體和溶 酶體的融合,阻斷自噬體的成熟。本研究結果表明：3-ma 可以一定程度抑制 lc3 的轉換;另 一方面 cq 能有效地抑制自噬體的成熟和 lc3-ii 在溶酶體內的降解,反映自噬被阻斷。acc-m 細胞在含有 5 mm 3-ma 和 5m obatoclax 培養(yǎng)基內培養(yǎng) 48 小時后，如圖 3 所示，細胞活力分析提示 obatoclax 的細胞毒性比對照組(只含 5mobatoclax)升高，其 ic50 值從 10m 減少到 3m。當細胞在 20mcq 預處理 2h 后再加入 5mobatoclax,也能得 出類似的結果。此外，如圖 4 所示 western blot 結果提示 3-ma 抑制自噬后 caspase-3 裂解顯 著增多。這些結果表明，抑制 obatoclax 誘導自噬可以促進細胞凋亡。圖 3mtt 實驗結果顯示 3-ma+obatoclax 共同培養(yǎng) 48h 后細胞抑制率明顯高于 obatoclax 組fig. 3 the mtt assay result showed that the cell inhibition rate was significantly higher when acc-m cells were co-culture with 3-ma and obatoclax for 48h than obatoclax alone125130135140145150圖 4 3-ma 有效抑制 obatoclax 誘導的自噬，同時引起 caspase-3 的裂解fig. 4 3-ma effectively inhibited obatoclax-induced autophagy, and caused the cleavage of caspase-33討論許多前期臨床研究已證實在各種血液腫瘤細胞，包括慢性粒細胞白血病，淋巴瘤和骨髓 瘤6，固體腫瘤，包括非小細胞肺癌，前列腺癌，結腸癌和子宮頸癌中 obatoclax 均有抗腫 瘤作用7?，F在，它在不同類型的惡性腫瘤如小細胞肺癌等治療已經進入期臨床試驗8。 作為一個 bh3 結構類似物，合成 obatoclax 的目的是要拮抗抗凋亡 bcl-2 蛋白。它已被 證明能夠有效誘導線粒體途徑的凋亡,并且依賴于 bax 和 bak9。最近的研究表明 obatoclax 同時誘導自噬，這與我們的結果相一致，可能是因為 obatoclax 能夠將 beclin 1 從 beclin 1 與 bcl-2 的結合中釋放出來從而誘導自噬10。然而，obatoclax 誘導的自噬與凋亡之間的關 系錯綜復雜，在不同類型的腫瘤細胞，對不同的刺激和不同的環(huán)境下自噬與凋亡之間存在截然不同的關系。a eisenberg-lerner 總結為：自噬可起合作、拮抗或者促細胞凋亡的作用11。 在這項研究中，我們提供的證據表明 obatoclax 誘導的自噬能夠減少細胞凋亡。細胞活力實驗及 westernblot 數據表明 obatoclax 本身并沒有引起 acc-m 細胞明顯的凋亡，但當自 噬受到 3-ma 或 cq 抑制后，細胞凋亡明顯增加。pan10等人發(fā)現在食道癌，骨肉瘤的腫瘤 細胞株中，obatoclax 誘導的自噬具有細胞保護作用，本實驗結果與之相一致。自噬這種抗凋亡的作用可能解釋為：首先當能量和營養(yǎng)缺乏時，自噬降解細胞器和大分 子提供的能量和營養(yǎng)以維持細胞存活。當腫瘤細胞受到化療或放療刺激后，自噬能夠去除受 損的細胞器（如線粒體），折疊的蛋白質和活性氧（ros）從而保持基因組的完整性12-13。 因此，抑制在乳腺癌，前列腺癌和結腸癌細胞的自噬能夠有效增強放療誘導的凋亡14-15。4結論本研究證明 obatoclax 能夠誘導在人唾液腺腺樣囊性癌 acc-m 細胞中誘導自噬，并且 證實 obatoclax 誘導的自噬具有保護細胞的作用。而唾液腺腺樣囊性癌細胞中的自噬與凋亡 的關系，及其分子機制尚待進一步研究。參考文獻 (references)1551 rapidis ad, givalos n, gakiopoulou h, faratzis g, stavrianos sd, vilos ga, et al. adenoid cystic carcinoma of the head and neck. clinicopathological analysis of 23 patients and review of the literature j. oral oncol, 2005. 41:328-335.1601651701751801852 norberg-spaak l, dardick i, ledin t. adenoid cystic carcinoma: use of cell proliferation, bcl-2 expression, histologic grade, and clinical stage as predictors of clinical outcome j. head neck, 2000, 22(5):489-497.3 chen n, karantza-wadsworth v. role and regulation of autophagy in cancer j. biochim biophys acta, 2009,1793: 1516-23.4 giansanti v, 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