[精品論文]胰腺癌細胞中 MEK1 和 MEK2 的差異功能.doc

精品論文胰腺癌細胞中 mek1 和 mek2 的差異功能解析譚曉冬，周磊，王懷濤，朱海軍，張峻，李捍司，王兆平，孫楊，楊一帆5（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胰腺甲狀腺外科，沈陽 110004） 摘要：絲裂原活化蛋白激酶激酶 1/2（mitoge-activated protein kinase kinase 1/2, mek1/2）信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用。能夠抑制 mek1/2 活化的小分子化合物可成為抗 腫瘤藥物開發(fā)的靶點。但 mek1 和 mek2 在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未清楚。為了 探究胰腺癌細胞系中 mek1 和 mek2 的不同功能，我們利用基因敲減技術(shù)分別抑制 mek110和 mek2 的 mrna 合成。我們對 mek1 及 mek2 基因敲減的胰腺癌細胞系 pc-1.0 進行細 胞形態(tài)學(xué)、增殖、有絲分裂阻滯（mitotic arrest）和體外侵襲能力實驗。結(jié)果顯示 mek1 表 達的抑制能夠特異性抑制細胞增殖和 g0/g1 轉(zhuǎn)化。而 mek2 表達的抑制特異改變細胞形態(tài) 及抑制胰腺癌細胞的侵襲能力。在胰腺癌細胞系中 mek1 和 mek2 調(diào)控不同的生物學(xué)反應(yīng)。 在胰腺癌治療中，mek1 和 mek2 可成為抑制特異細胞功能的不同靶點。15關(guān)鍵詞：胰腺癌；mek1；mek2；基因干擾；功能調(diào)節(jié)中圖分類號：r735.9mek1 and mek2 isoforms regulate distinct functions in pancreatic cancer cells20tan xiaodong, zhou lei, wang huaitao, zhu haijun, zhang jun, li hansi,wang zhaoping, sun yang, yang yifan(department of pancreatic and thyroid surgery, shengjing hospital, china medical university,shenyang 110004)abstract: the mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (mek1/2) signalling pathway plays a25central role in tumour progression. small molecules that inhibitor mek1/2 are therefore considered attractive candidates for anti-cancer drugs. however, the exact contributions of mek1and mek2 to the development of pancreatic cancer remain to be established. to differentiate the functions of mek1 and mek2 in a cultured pancreatic cancer cell line, we utilised shrna-mediated knockdown of their two mrnas individually. we studied the effects of mek130and mek2 knockdown on cell morphology, proliferation, mitotic arrest, and in vitro invasion capability in pc-1.0 cells. the results showed that inhibition of mek1 expression was an effective and specific approach to inhibit cell proliferation and induce g0/g1 arrest. on the other hand, mek2 knockdown specially altered cell morphology and inhibited the invasive ability of pancreatic cancer cells. therefore, mek1 and mek2 mediate different biological responses in35cultured pancreatic cancer cells. these proteins could become distinct targets for the inhibition of specific cellular functions in the treatment of pancreatic cancer.keywords: pancreatic cancer; mek1; mek2; rnai; function regulation0引言40胰腺癌常伴隨廣泛的侵襲和/或轉(zhuǎn)移，無法進行治療性外科手術(shù)治療。以侵襲/轉(zhuǎn)移相關(guān) 因子為靶點的分子治療方法的發(fā)展為提高胰腺癌患者預(yù)后提供了新途徑。但胰腺癌侵襲/轉(zhuǎn) 移的細胞及分子機制尚不清楚。利用 bop 誘導(dǎo)的敘利亞倉鼠實驗性胰腺癌模型，經(jīng)胰腺內(nèi)移植（intra-pancreatic transplantation）后，建立兩種胰腺癌細胞系 pc-1（非解離型低轉(zhuǎn)移株）和 pc-1.0（解離型基金項目：高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（20092104120014）作者簡介：譚曉冬，（1971-），男，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究。e-mail:- 9 -45高轉(zhuǎn)移株），具有了不同的侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能1-3。前期研究中我們利用表達差異分析方法（representational difference analysis, rda）發(fā)現(xiàn) pc-1.0 和 pc-1 細胞的基因表達存在差異。 mek2 是與 pc-1.0 和 pc-1 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子4。進一步研究發(fā)現(xiàn) mek2 參 與調(diào)控倉鼠及人胰腺癌細胞的侵襲/轉(zhuǎn)移5。mek2 作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, mapk）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通50路中的重要激酶之一，參與了較多細胞生化過程，包括細胞增殖、分化，細胞分裂，應(yīng)激和 細胞凋亡6-9。mapk 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路幾乎存在于所有真核生物細胞中，可分為三種激酶體系： mapk，絲裂原活化蛋白激酶激活劑（map kinase kinase，mkk 或 mek）和絲裂原活化蛋 白激酶激酶激活劑（map kinase kinase activator，mapkkk）10。mek1 和 mek2 是 mek 家族的兩種同分異構(gòu)體，通常表達為 mek1/2。二者擁有 85%相同的氨基酸序列，并在細胞55系及組織中特異表達。二者通常被認為具有相同的功能，但是有文獻報道二者可能通過不同 途徑調(diào)控并產(chǎn)生不同的功能11-13。迄今 mek1 和 mek2 在胰腺癌細胞中的作用尚未清楚。 為進一步闡明 mek1 和 mek2 在胰腺癌細胞中的不同功能調(diào)控機制，我們利用逆轉(zhuǎn)錄 病毒，通過短發(fā)卡 rna（short-hairpin rnas, shrnas）技術(shù)分別沉默解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細胞 pc-1.0 細胞中 mek1 和 mek2 的基因表達，并進一步檢測相應(yīng)基因功能。601材料和方法1.1 細胞系和細胞培養(yǎng)采用倉鼠非解離型低轉(zhuǎn)移株胰腺癌細胞系 pc-1 細胞和解離型高轉(zhuǎn)移株胰腺癌細胞系 pc-1.0 細胞。pc-1 細胞系是利用 bop 誘導(dǎo)的敘利亞倉鼠實驗性胰腺癌模型建立1。pc-1.0 細胞系是由同系倉鼠皮下接種 pc-1 細胞后產(chǎn)生的腫瘤而建立2。上述兩種細胞系呈不同形65態(tài)學(xué)方式生長。pc-1 細胞呈島樣細胞克隆方式生長，pc-1.0 細胞主要呈單個細胞方式生長3。采用 pc-1.0 細胞的亞克隆表達 mek1 或 mek2 的 shrna。采用 gp2-293 包裝細胞復(fù) 制逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述細胞系均以 rpmi-1640 培養(yǎng)液（gibco-brl, grand island, ny）培養(yǎng)，并加 10胎70牛血清（bioserum, victoria, australia）、100 u /ml 青霉素 g 和 100 g /ml 鏈霉素，于含 5co2 37孵箱內(nèi)培養(yǎng)。上述細胞在進行免疫細胞學(xué)實驗前無血清培養(yǎng)。1.2 抗體本實驗中利用兔抗人的 mek1、mek2 及 -actin 多克隆抗體（santa cruz biotechnology, santa cruz, ca）作為一抗。利用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗體和 fitc 標(biāo)記的熒光抗體（santa75cruz biotechnology, santa cruz, ca）作為第二抗體。1.3 抗 mek1 和抗 mek2 的 rnai 序列設(shè)計和 shrna 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達和分布 mek1 和 mek2 特異性靶點序列根據(jù)在/rnaidesigner上的綜合 網(wǎng)站上（comprehensive online）rnai 工具（clontech laboratories, inc., ca, usa），利用 mek1(gene bank accession no. nm_002755) 和 mek2 （ gene bank accession no.80nm_030662 ） 相 關(guān) 序 列 設(shè) 計 而 建 立 。 mek1shrna標(biāo) 記mrna（5-ggagaagcacaagaucaug-3 ）的 nt 為 614-632 ，mek2 shrna 標(biāo)記 mrna（5-ccuggacuauauugugaac-3）的 nt 為 1216-1234，二者根據(jù)之前設(shè)計經(jīng)過化學(xué)合859095100105110115120成并克隆進入逆轉(zhuǎn)錄病毒 psiren-retroq-zsgreen14。利用 bigdye terminator sequencing kit 的 abi prism 3100 genetic analyzer 檢測病毒帶菌體的序列確認 shrna 的插入（applied biosystems, ca, usa）。1.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)和感染應(yīng)用 lipofectamine 2000 (invitrogen, carlsbad, ca, usa)試劑盒將 gp2-293 細胞（8105） 與包裝帶菌體（packaging vector）pvsv-g 和含有 mek1 或 mek2 shrna 插入序列(clontech laboratories, inc., ca, usa)的 rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 帶菌體共同轉(zhuǎn)染。對照細 胞系由 gp2-293 細胞與相應(yīng)的空白帶菌體（rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 和 pvsv-g） 感染而來。轉(zhuǎn)染后上述細胞系在 rpmi 1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 48 小時。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn) 染和表達用戶手冊（pt3132, clontech laboratories, inc., ca, usa），將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的細 胞上清液過濾并感染 pc-1.0 細胞。為了得到 mek1 和 mek2 沉默的細胞株，我們利用免疫 熒光顯微鏡進行克隆篩選，并分別進行培養(yǎng)和進一步功能分析。1.5 應(yīng)用 rt-pcr 對 mek1 和 mek2 mrna 表達的分析總 rna 由 mek1 或 mek2 shrna 表達和感染空白帶菌體的 pc-1.0 細胞分離提取。利 用 superscript ii 試劑盒（life technologies, inc.），從每個樣本中取 1 g 反轉(zhuǎn)錄成 cdna5。 mek1、mek2 和 -actin 的特異 pcr 引物序列如下：mek1：5-attattgttcccctaagtggattg-3（forward）5-ttacaacagcattggtacttggat-3（reverse）；mek2：5-gcagtcggacatctggagca-3（forward）5-caccgttgggcagcttagga-3（reverse）；-actin：5-gtggggcgccccaggcacca-3（forward）5-ctccttaagtcacgcacgattcc-3（reverse）；-actin 作為標(biāo)準化對照（normalising control）。經(jīng)最初 95變性 5 分鐘后，按照 94 30 秒、55 30 秒、72 1 分鐘進行 pcr 30 個循環(huán)，最后經(jīng) 72延伸 7 分鐘。每個實驗均重 復(fù)三次。為了進行 mrna 定量，樣本均與標(biāo)準化對照即 -actin mrna 的表達進行比較，并 應(yīng)用 genesnap 和 genetools 軟件（syngene, cambridge uk）進行結(jié)果分析。1.6 應(yīng)用 western blotting 對 mek1 和 mek2 蛋白水平表達的分析于直徑 90mm 培養(yǎng)皿中加入含 10%小牛血清的 rpmi 1640 培養(yǎng)液 10ml，進行細胞培養(yǎng)。 應(yīng)用 1ml 預(yù)冷的 ripa 裂解液（50mm tris，150ml nacl，1% np-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% sds，ph 7.5 1mm 苯甲磺酰氟，使用前加入 1mg/ml leupeptin 和 1mg/ml aprotinin）冰上裂解 細胞 15 分鐘。經(jīng) 4 5000 rpm 5 分鐘離心后，取上清液并分裝貯存于-80冰箱備用。-actin 作為內(nèi)參。western blot 方法同前15。即將總蛋白質(zhì)含量相同的不同樣本（20 g）利用聚丙烯酰胺 平板凝膠電泳按分子量分離，后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到 pvdf 膜（bio-rad, anaheim, usa）上。 然后，將 pvdf 膜與 0.1% tween-20/pbs 稀釋的一抗共同于 4下孵育過夜。辣根過氧化物 酶標(biāo)記的二抗以 0.1% tween-20/pbs 按 1：5000 稀釋，并與一抗孵育后的膜共同孵育?？?達膠片(eastman kodak company, rochester, ny) 加入增強型化學(xué)發(fā)光劑（santa cruz biotechnology, santa cruz, ca）以探測收集蛋白條帶光信號。1251301351401451501551.7 體外細胞增殖實驗我們將 mek1 基因敲減、mek2 基因敲減及空白對照的 pc-1.0 細胞分別以 5000 個/孔 的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中，同時加入含 10% fbs 的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng) 3 天后，按照 產(chǎn)品說明應(yīng)用 cck-8 試劑盒（cell counting kit 8, dojindo co., kumamoto, japan）對有活力 的細胞進行計數(shù)。該試劑為一種四唑鹽復(fù)合物（wst-8），與活細胞內(nèi)特異物質(zhì)反應(yīng)形成一 種有顏色物質(zhì)并在 450nm 有吸收高峰，即 450nm 時該物質(zhì)的量直接反映了培養(yǎng)基中活細胞 的數(shù)量。各實驗均重復(fù)接種于 3 個孔中。1.8 細胞周期實驗應(yīng)用 pi（propidium iodide）對 dna 染色以分析細胞周期和有絲分裂阻滯的變化。細胞 經(jīng)胰酶消化、沉淀，再用預(yù)冷的 pbs（phosphate-buffered saline）制成細胞懸液。將預(yù)冷的95%乙醇 three volume 緩慢加入此細胞懸液并輕輕震蕩。預(yù)冷試劑和緩慢加入乙醇的目的在 于減少細胞聚集后沉淀。用等量的 pi 溶液（30 g/ml，溶于 pbs）和 rnase a 溶液（100 g/ml， 溶于 pbs）再次制成細胞懸液。已染色的細胞在 4下避光保存過夜。應(yīng)用 facscan 流式 細胞儀（becton dickinson, san jose, ca）對細胞周期進行分析，觀察細胞處于 g1 期、g2 期 和 s 期的比例。1.9 體外侵襲實驗應(yīng)用 invasion chambers（becton dickinson labware, bedford, ma）進行體外侵襲實驗。1ml 含 10fbs 的 rpmi-1640 培養(yǎng)液作為化學(xué)誘導(dǎo)物、相同劑量 balb/3t3 細胞的無血清 條件培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)板孔中。將 mek1 基因敲減、mek2 基因敲減和空白對照的 pc-1.0 細胞的細胞懸液（1x105/ml）約 500l 以及等量的相應(yīng)實驗原料一起加入到 transwell 的內(nèi)室 中。上述細胞 37培養(yǎng) 12 小時后，用棉拭子擦去濾膜上表面的殘留細胞，對已遷移到濾膜 下表面的細胞進行固定并應(yīng)用 diff-quik 試劑（dade behring, dugen, switzerland）染色，之 后在 1mm2 網(wǎng)格上計數(shù)細胞核數(shù)目以確定濾膜下表面遷移細胞的數(shù)目（x100 倍放大）。1.10統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準差形式表示。通過 stat view 計算機軟件（sas institute，inc.，cary，nc）利用非配對 students t 檢驗評估每個分組之間的差異。p0.05 認為差異具有顯著性。2結(jié)果2.1 mek1 shrna 和 mek2 shrna 質(zhì)粒的建立為進行細胞功能實驗，應(yīng)用含有 mek1 或 mek2 shrna 的 psiren-retroq-zsgreen 帶 菌體阻滯 mek1 或 mek2 的表達。經(jīng)空白對照反轉(zhuǎn)錄病毒感染的 pc-1.0 細胞在細胞形態(tài)學(xué)、 細胞增殖、細胞周期和體外侵襲實驗方面與未感染的 pc-1.0 細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)空白質(zhì)粒 本身不影響 pc-1.0 細胞的生物功能（數(shù)據(jù)未給出）。為了阻滯內(nèi)源性 mek1 或 mek2，我 們在 rnai-ready psiren-retroq-zsgreen 上對兩個基因各選擇了三種 shrna 序列。我們發(fā) 現(xiàn)所選擇的 shrna 均分別降低內(nèi)源性 mek1 或 mek2 mrna 的表達，其中減少最多的分 別是 mek1 shrna 3（98.4%）和 mek2 shrna 3（77.5%）（圖 1）。與空白質(zhì)粒組比較， mek1 shrna 3 和 mek2 shrna 3 作用后明顯抑制 mek1 和 mek2 的蛋白表達（圖 2）。 故篩選出這兩種帶菌體進行下一步實驗。160165圖 1 經(jīng) shrna 基因敲減調(diào)節(jié)后 pc-1.0 細胞中 mek1 和 mek2 mrna 表達變化；與對照組相比，表達mek1 shrna 的 pc-1.0 細胞中 mek1 mrna 表達水平顯著降低，而 mek2 表達沒有變化。同樣，mek2 shrna 顯著降低 mek2 mrna 表達水平而 mek1 表達無明顯變化。-actin 為標(biāo)準化對照。圖 2 經(jīng) mek1 或 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細胞中 mek1 或 mek2 的蛋白表達變化；與對照組相比，有 mek1 shrna 表達的 pc-1.0 細胞中 mek1 蛋白表達水平顯著降低，而 mek2 沒有變化。mek2 shrna 顯 著降低 mek2 蛋白表達水平而對 mek1 表達沒有作用。-actin 作為內(nèi)參。2.2 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞的形態(tài)學(xué)和生長方式變化實驗結(jié)果表明 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞以克隆方式生長。而 mek1 基因敲減的細 胞在細胞生長方式方面與空白質(zhì)粒感染的 pc-1.0 細胞沒有變化（圖 3）。170175180185圖 3 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細胞的形態(tài)學(xué)變化；與對照組（a）相比，mek2 基因敲減顯著 誘導(dǎo)了 pc-1.0 細胞（c）的細胞集聚。而經(jīng) mek1 基因敲減 pc-1.0 細胞（b）未表現(xiàn)出顯著的細胞生長方 式變化。免疫熒光圖像顯示了對照組（d）、mek1-shrna 組（e）和 mek2-shrna 組（f）細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染情況。2.3 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞的增殖變化對 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 胰腺癌細胞的細胞增殖進一步進行研究。結(jié)果發(fā) 現(xiàn) mek1 基因表達下調(diào)抑制 pc-1.0 細胞的增殖（圖 4）。尤其在培養(yǎng) 48 小時和 72 小時以 后，pc-1.0 細胞增殖活動顯著減低，與空白對照細胞相比抑制率分別為 62.0%和 60.5%（p0.05）。圖 4 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細胞的增殖變化；pc-1.0 細胞經(jīng) mek1 基因敲減后在培養(yǎng) 48 小 時和 72 小時后表現(xiàn)出明顯的抗增殖作用。而 mek2 基因敲減在細胞生長或增殖的抑制方面沒有明顯作用。1901952.4 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞的細胞周期變化我們應(yīng)用 facscan 流式細胞儀對 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞進行細胞周 期分布分析。在 mek1 基因敲減細胞中只有 8.1%0.7%的細胞處于有絲分裂的 s 期。而空 白對照 pc -1.0 細胞中有 26.6%5.4%的細胞處于 s 期（p 0.05，圖 5）。圖 5 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細胞的有絲分裂阻滯變化；mek1 基因敲減減少了處于 s 期 pc-1.0 細胞的百分比，而 mek2 基因敲減后 pc-1.0 的細胞周期沒有明顯變化。黑色條帶，含有空白質(zhì)粒的對照 pc-1.0 細胞；斑點條帶，mek1 基因敲減的 pc-1.0 細胞；白色條帶，mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞。s， 顯著；ns，不顯著。2002052.5 mek1 和 mek2 基因敲減的 pc-1.0 細胞的體外侵襲能力變化如圖 6，空白對照細胞表現(xiàn)出較強的侵襲能力（侵襲細胞數(shù)=52.65.8）。而與空白對照 細胞相比，mek2 基因敲除顯著抑制了 pc-1.0 細胞的侵襲能力（侵襲細胞數(shù)=20.13.1, p 0.05）。圖 6 mek1 和 mek2 基因敲減后 pc-1.0 細胞的侵襲能力變化；與含有空白質(zhì)粒的對照 pc-1.0 細胞相比， mek2 基因敲減顯著抑制了 pc-1.0 細胞的侵襲能力。而 mek1 基因敲減后并沒有影響細胞的侵襲能力。s， 顯著；ns，不顯著。精品論文2102152202252302352402452502553討論mek 蛋白家族包含多個調(diào)節(jié)位點，多種信號分子能與這些位點結(jié)合。mek1 和 mek2 在兩個部位存在較大的不同：氮端的 erk 結(jié)合位點和磷酸化位點，可與幾種其他信號蛋白 結(jié)合。mek1 和 mek2 在重要位點上的差異提示二者可能具有不完全相同的功能。有研究 利用基因敲除大鼠進行實驗指出 mek1 和 mek2 蛋白存在功能差異，支持以上假說12, 16。 另據(jù)文獻指出 mek1 和 mek2 在肝細胞中表現(xiàn)出特異的功能。mek2 調(diào)節(jié)細胞生存，而 mek1 參與細胞增殖17。在近期的研究中，將 mek1 和 mek2 基因從胰腺癌細胞中敲減以 研究二者的功能變化。一些 mek1/2 的小分子抑制劑（如 u0126）已成為癌癥分子靶向治療 的候選分子5, 18，但大部分抑制劑同時阻滯 mek1 和 mek219。因此這些抑制劑缺乏特異 性。而 rnai 被認為是檢測基因功能的強大工具，并在治療癌癥等疾病方面作為經(jīng)典治療方 法20。4結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞中 mek1 和 mek2 調(diào)節(jié)不同的生物功能。mek1 而不是 mek2 的表達抑制是抑制細胞增殖和誘導(dǎo) g0/g1 阻滯的特異且有效的方法。而 mek2 mrna 特異 性改變細胞形態(tài)和抑制細胞侵襲能力?？傊?，表達 mek1 和 mek2 shrna 的重組逆轉(zhuǎn)錄病 毒在胰腺癌治療方面可作為一種值得探索的手段。參考文獻 (references)1 egami h, takiyama y, cano m, houser wh, pour pm. establishment of hamster pancreatic ductal carcinoma cell line (pc-1) producing blood group-related antigensj. carcinogenesis 1989; 10: 861-869.2 egami h, tomioka t, tempero m, kay d, pour pm. development of intrapancreatic transplantable model of pancreatic duct adenocarcinoma in syrian golden hamstersj. am j pathol 1991; 138: 557-561.3 pour pm, egami h, takiyama y. patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its 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