[精品論文]DLL4 siRNA 對缺氧血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和脈絡(luò).doc

精品論文dll4 sirna 對缺氧血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管管 腔形成的影響5何花，李斌（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，武漢 430030） 摘要：【目的】 delta 樣配體 4 (dll4)是 notch 信號通路血管內(nèi)皮特異性配體，在調(diào)節(jié)生理 及病理性血管形成中起重要作用。有研究表明 dll4-notch 信號通路受缺氧調(diào)節(jié)，可通過抑 制血管分支形成促進(jìn)血管成熟抑制過度血管化。脈絡(luò)膜新生血管(cnv) 是一種病理性新生10血管，已知缺氧在其形成中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究 dll4 在脈絡(luò)膜新生血管形成中 的作用和機(jī)制?！痉椒ā?用 200 mol/l cocl2 造成體外細(xì)胞化學(xué)性缺氧，以探究 dll4 對 缺氧條件下 cnv 形成過程中的主要參與細(xì)胞血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（epc）和脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi) 皮細(xì)胞 (rf/6a 細(xì)胞) 生物學(xué)功能的影響。dll4 sirna 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后, 利用 rt-pcr, real-time pcr 和蛋白印跡技術(shù)研究缺氧條件下 rf/6a 細(xì)胞中 dll4 和其下游主要基因 hes1，hey115的 mrna 和蛋白表達(dá)變化。并進(jìn)一步研究 dll4 sirna 對缺氧下 epc 和 rf/6a 細(xì)胞參與新 生血管形成的生物學(xué)功能（包括細(xì)胞增殖，移行以及管腔形成）的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)立三組對照：分別為無轉(zhuǎn)染的空白對照、轉(zhuǎn)染試劑對照及 scrambled 陰性對照?！窘Y(jié)果】缺氧導(dǎo)致體外 rf/6a 細(xì)胞中 dll4 表達(dá)上調(diào)。轉(zhuǎn)染 dll4sirna-duplex 1 后，dll4 mrna 的表達(dá)水平較 scrambled 陰性對照組下降 91.4% ，其蛋白表達(dá)亦相應(yīng)減少，而三個(gè)對照組間 dll4 表達(dá)無20明顯差異。 此外，缺氧條件下轉(zhuǎn)染 sirna-duplex 1 后，rf/6a 細(xì)胞中 dll4-notch 信號通 路下游的 hes1 和 hey1 基因的 mrna 表達(dá)較 scrambled 陰性對照組分別下降 75.1% 和86.3%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), dll4 低表達(dá)可促進(jìn)缺氧下 rf/6a 細(xì)胞增殖，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞周期 s期。dll4 sirna 可促進(jìn)缺氧下 epc 和 rf/6a 細(xì)胞移行及血管管腔形成(p 0.05)?！窘Y(jié)論】dll4 是新生血管分支形成及血管出芽的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下 dll4 信號途徑在血管25內(nèi)皮祖細(xì)胞和脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管管腔形成中發(fā)揮著重要作用，dll4 可能成為脈絡(luò)膜新生血管疾病治療的新靶點(diǎn)。 關(guān)鍵詞：dll4；sirna；脈絡(luò)膜新生血管；血管內(nèi)皮祖細(xì)胞；脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞；缺 氧；30effect of dll4 sirna on proliferation,migration and tube formation of endothelial precursor cells and choroid-retinalendothelial cells under hypoxic conditionshe hua, li bin(department of ophthalmology,tongji hospital affiliated to tongji medical college,huazhong35university of science and technology, wuhan 430030)abstract:【objective】dll4 (delta-like 4) is an endothelium specific notch ligand and has beenshown to function as a regulating factor during physiological and pathological angiogenesis. choroidal neovascularization (cnv) is a pathological form of angiogenesis in which hypoxia is thought to play an important role. however, the role of dll4 in the development of cnv is still40poorly understood. 【methods】 the study utilized chemical hypoxia induced by 200m cocl2 toobserve the expression of dll4 in endothelial precursor cells and choroid-retinal endothelial cells(rf/6a cells) which are the primary cells involved in cnv. after transfection of a dll4 sirna, mrna and protein expression of dll4 and key downstream genes, including hes1 and hey1, in hypoxic rf/6a cells were investigated by rt-pcr, real-time pcr, and western blot analysis.基金項(xiàng)目：教育部新教師基金項(xiàng)目（基金編號 20090142120068）作者簡介：何花，女，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：眼脈絡(luò)膜新生血管的基礎(chǔ)研究. e-mail:- 15 -45the effects of the dll4 sirna on the biological function of hypoxic endothelial precursor cells and rf/6a cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and, tube formation,were investigated. 【results】 the results in vitro showed that hypoxic conditions lead toupregulation of dll4 expression in rf/6a cells. after transfection, sirna-duplex1 targetingdll4 depleted the dll4 mrna levels by as much as 91.4 compared with the scrambled50sirna control, and dll4 protein expression was similarly effected. in addition, after transfection of hypoxic rf/6a cells with the dll4 sirna-duplex1, the mrna levels of hes1 and hey1,which function downstream of dll4-notch signaling, were lowered by 75.1 and 86.3,respectively, compared with the scrambled sirna control. furthermore, knockdown of dll4 expression significantly promoted the proliferation of hypoxic rf/6a cells and led to their arrest55in the s phase of the cell cycle. migration and tube formation of hypoxic endothelial precursor cells and rf/6a cells were significantly induced by the dll4 sirna, compared with thescrambled sirna (p 0.05). 【conclusion】dll4 functions as a negative regulator of angiogenicbranching and sprouting. based on our results, dll4 signaling appears to play an essential role in the biological behavior of endothelial precursor cells and choroid vascular endothelial cells under60hypoxia. as such, dll4 may represent a novel target for cnv therapy in the future.keywords: dll4; sirna; choroidal neovascularization; endothelial precursor cells; choroid- retinal endothelial cells; hypoxia0引言65血管新生是指在生理或病理?xiàng)l件下從已有的血管發(fā)展而形成新的血管，此過程包含了內(nèi) 皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，移行以及血管管腔形成等重要環(huán)節(jié)。脈絡(luò)膜新生血管合并年齡 相關(guān)黃斑變性是發(fā)達(dá)國家 60 歲以上人群視力不可逆性喪失的主要原因。其主要特征為脈絡(luò) 膜新生血管通過 bruch 膜侵及視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜下1,2。脈絡(luò)膜新生血管發(fā)病受多種因素控制，機(jī)制復(fù)雜。目前研究表明缺血缺氧在其形成過70程中起重要作用。而 hif-1 和血管內(nèi)皮生長因子 vegf 是缺氧條件下 cnv 的主要因子3-7。 過去的幾十年里，cnv 治療重點(diǎn)為抑制 vegf 信號通路，但其療效有限，很少有新生血管 永久退化，往往數(shù)月后新生血管重新生成8。這就提示臨床抗新生血管治療亟需新的靶點(diǎn)或 方法。delta 樣配體 4 是生理及病理血管過程中 notch 信號通路的特異性配體。與 hif-1 和75vegf 相似，亦是缺氧調(diào)節(jié)基因。目前研究表明 dll4-notch 信號通路是新生血管出芽的重 要途徑9-11。dll4 的表達(dá)可抑制在血管生成中活躍的頂細(xì)胞，dll4-notch 信號通路通過抑 制血管分支形成，促進(jìn)血管成熟來抑制新生血管過度形成12-17 。更有趣的是，在體阻滯 dll4-notch 信號通路可促進(jìn)過度但無功能新生血管形成以達(dá)到阻止腫瘤生長的目的。因此， dll4-notch 信號通路提供了有別于目前治療方案的血管靶向分子路徑18,1980在 cnv 動(dòng)物模型中, rbp-j-介導(dǎo)的 dll4-notch 信號通路在血管新生中起重要作用 20。盡管 dll4 是腫瘤生長過程中調(diào)節(jié)血管新生的靶點(diǎn)，但是其對 cnv 抑制作用尚不清楚， 尤其是對脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能知之甚少。為了解 cnv 形成中 dll4 的表達(dá)及作用，我們體外用血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng) 膜內(nèi)皮細(xì)胞(rf/6a 細(xì)胞)來研究缺氧條件下其 dll4 表達(dá)變化。更進(jìn)一步用 dll4 sirna 沉85默 dll4 表達(dá)來研究 dll4 對缺氧下血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和 rf/6a 細(xì)胞增殖，遷移以及管腔形 成的影響。1研究方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧方案取 200ml 人外周血，用 ficoll 液分離人 pbmnc，用 ebm-2+1%fbs 約 20ml 重懸，分90別加入 4 塊預(yù)包被纖維連接蛋白（fn，5ug/cm）的 100mm 培養(yǎng)板。置于 co2 培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng) 4-6h 后，吸去懸浮細(xì)胞（為增加細(xì)胞純度，可用膠頭滴管清清吹洗培養(yǎng)平面），每板加 入 5-8ml egm-2 mv bulletkit 培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液，除凈懸浮細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)。選取 生長狀態(tài)良好的原代培養(yǎng)第 5 天的 epc（day5）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。從上海中科院細(xì)胞庫獲取脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系 (rf/6a 細(xì)胞),在含 10%胎牛血清95(gibco), 100 u/ml 青霉素,100 g/ml 鏈霉素的 dmem 培養(yǎng)基培養(yǎng)。血管性血友病因子(santacruz biotech., usa)免疫染色鑒定。細(xì)胞缺氧處理之前給予含 1%胎牛血清的 dmem 培養(yǎng)。分別培養(yǎng) 1, 6, 12 及 24 小時(shí)后加入 200mol/l cocl2形成缺氧環(huán)境。轉(zhuǎn)染組給予 sirna 轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后加入 200 mol/lcocl2繼續(xù)培養(yǎng) 12 小時(shí)。1001.2 分離 rna按制造商說明用 trizol (invitrogen, usa)提取培養(yǎng)細(xì)胞全部 rna。75%乙醇洗滌后放入20 l 無核酸水中。分光光度儀測定 rna 的濃度及純度。od1.3 逆轉(zhuǎn)錄 pcr 與實(shí)時(shí)定量 pcr260/ od280= 1.9 - 2.0。105110利用 cdna synthesis kit (revertaid first-strand cdna synthesis kit, canada)對 rf/6a 細(xì) 胞全部 rna 行逆轉(zhuǎn)錄。由中國上海 genechem 公司對 dll4, hes1, hey1 and gapdh 進(jìn)行 引物設(shè)計(jì)及合成。引物序列如表 1 所示。表1 pcr引物序列tab. 1. primers used for pcr analysisgeneprimer sequenceproduct size. bp115120dll4 forward primer: 5-acggggacctactgtgaacg-3 337reverse primer: 5-gcagcaccagcagcaccgccag-3hes1 forward primer: 5-ctaccccagccagtgtcaaca -3 271reverse primer: 5-aacgcagtaccggcgagtg -3hey1 forward primer: 5-cggcaggagggaaaggcta -3 248reverse primer: 5-cgggtgatgtccaaaggcag -3gapdh forward primer: 5-accacagtccatgccatcac -3 452reverse primer: 5-tccaccaccctgttgctgta -3125取 25ul 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-pcr。95c 5 min 變性后 95c30 s, 58c 45 s,72c 30 s 35 個(gè)周期 ，72c，3 min 產(chǎn)物延伸。從 25 l pcr 反應(yīng)產(chǎn)物中取出 5ml 放入 2%瓊脂糖凝膠中紫外光下觀 察。利用 abi prism 7500 系統(tǒng) (biosystems, usa)，用 sybr green (takara bio., japan)對 dll4、hes1 以及 hey1 mrna 表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 pcr 檢測。每個(gè) cdna 樣本放130135140145150155160165入含 1 l cdna，12.5 l sybr green rt-pcr master mix (2), 以及 1 l 引物 (10 mol/l)的 25 l 容器，重復(fù)檢測三次。實(shí)時(shí)定量 pcr 檢測步驟包括 95c 10 min 酶反應(yīng)，95c15 s 變性及 60c1 min 復(fù)性共 40 周期，最后 72c20 min 延伸。利用相對 ct (ct)計(jì)算基因表 達(dá)相對含量(biosystems 提供), 公式如下: 倍數(shù)改變=2-ct, ct 表示信號達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增循 環(huán)次數(shù)。1.4 蛋白印跡技術(shù)rf/6a 細(xì)胞放入 6 孔板，48 小時(shí)轉(zhuǎn)染后繼續(xù)缺氧培養(yǎng) 12 小時(shí)。pbs 沖洗 2 次后每孔給 予 100 l 裂解緩沖液，4c 冰浴 5min。依據(jù)生產(chǎn)商提供說明，用 bca protein assay kit (tianlai, china)測量分析蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣本 100c 加熱 10 min 后載入 5%sds-聚丙烯酰胺 凝膠，冰轉(zhuǎn)移緩沖液(25 mmol/l tris, 192 mmol/l 糖膠, 100%冰乙醇)中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂乳封閉，一抗為抗 dll4 兔多克隆抗體(abcam, usa)以及抗 gapdh 兔多克隆抗體（內(nèi)對照），結(jié)合辣根過氧化物酶的抗兔 igg 孵育。用增強(qiáng)化學(xué)免疫蛋白印跡試劑 pierce檢測 dll4 蛋白表達(dá)。dll4 蛋白條帶以 gapdh 標(biāo)準(zhǔn)化。重復(fù)測量三次。1.5 體外 si rna 轉(zhuǎn)染的檢測由 genechem 公司 (shanghai, china)化學(xué)合成 dll4 sirna： dll4-duplex-1 (100 nmol/l): gtaccttctcactcatcat; dll4-duplex-2(100nmol/l): gtttccccacagtgacaag;dll4 scrambled 對照 (100 nmol/l): actaccgtt- gttataggtg。轉(zhuǎn)染前 rf/6a 細(xì)胞在含 1% fbs 的 dmem 中孵育 24 小時(shí)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天按推薦密度接種：24 孔板: (5.08.0)104, 96 孔板: (0.53.0)104。依據(jù)產(chǎn)商說明通過 lipofectamine 2000 (invitrogen, usa)將 sirna 導(dǎo)入 rf/6a 細(xì)胞 。以無轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染試劑組，scrambled 陰性對 照組為三個(gè)對照組。sirna 轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后缺氧培養(yǎng) 12 小時(shí)再檢測 dll4mrna 及蛋白的表 達(dá)水平。dll4sirna 進(jìn)一步用于分析沉默 dll4 對主要下游基因 hes1 和 hey1 表達(dá)的影 響以及對 epc 和 rf/6a 細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。1.6 細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的檢測細(xì)胞分為四組:空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組，scrambled 陰性對照組及 dll4 sirna 組， 各組分別給予相應(yīng)的試劑處理細(xì)胞。epc 細(xì)胞各組給予相應(yīng)干預(yù)處理前用 ebm-2+1%fbs 培養(yǎng) 24h，使其同步化后，再加相 應(yīng)干預(yù)處理 24h、將加過藥物的培養(yǎng)液換成新的 ebm-2+1%fbs 繼續(xù)培養(yǎng) 0h、24h 和 48h， 分別在這 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)再加 mtt，4h 后測 od450 值。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)三個(gè)附孔。（增殖 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞可參考 5*103/ml 密度接種于 96 孔板內(nèi)。）利用流式細(xì)胞儀分析 dll4 sirna 對缺氧下 rf/6a 細(xì)胞周期的影響。將 rf/6a 細(xì)胞接 種在密度為每孔 1104 的 96-孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，過夜貼壁后換 1% fbs 的 dmem 培養(yǎng) 基 ，在轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)及 200 mol/l cocl2 缺氧 24, 48, 72 及 96 小時(shí)后加入 3-(4,5-二甲基-2- 噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑 (mtt) 。細(xì)胞進(jìn)一步孵育 4 小時(shí)， 培養(yǎng)基不受甲臜污染，每 孔加入二甲基亞砜(dmso; 100 l /孔)，曝光 10 分鐘后利用 elisa 閱讀器計(jì)算 570 nm 激光 吸收系數(shù)(a) 第 3 天更換培養(yǎng)基，每組使用三孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。為完成細(xì)胞周期分析, 將 rf/6a 細(xì)胞接種在密度為每孔 1106 的 6 孔板。細(xì)胞分為四組:空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組， scrambled 陰性對照組及 dll4 sirna 組。在轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)精品論文170175180185190195及缺氧 72 小時(shí)后依據(jù)生產(chǎn)商提供說明給予 bd cycletesttm plus dna reagent kit (bectondickinson, usa)。用 facs caliber cytometer (becton dickinson)對樣本進(jìn)行分析。每組使用 三個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。1.7 細(xì)胞遷移的檢測用纖維連接蛋白包被的孔徑為 8 m 的 transwell 小室對 epc 和 rf/6a 細(xì)胞遷移進(jìn)行分 析。經(jīng)過 48 小時(shí)轉(zhuǎn)染 5104 細(xì)胞接種至小室內(nèi)。上室用含 1% fbs 的 dmem 培養(yǎng)基孵育，1 小時(shí)后放入 24 孔板，細(xì)胞會(huì)越過微孔膜向含 dmem 及 10% fbs 200 mol/l cocl2 的下室 遷移。孵育 8 小時(shí)后膜上細(xì)胞經(jīng) 4% pfa 固定 giemsa 染色 15 min。用顯微鏡計(jì)數(shù)遷移細(xì) 胞數(shù)目，細(xì)胞分為四組: 空白對照組，轉(zhuǎn)染試劑對照組， scrambled 陰性對照組及 dll4 sirna 組。每個(gè)小室隨機(jī)選擇 5 個(gè)視野，每組檢測三個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。1.8 血管管腔形成的檢測設(shè)立三組對照：分別為無轉(zhuǎn)染空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、scrambled sirna 陰性對照組。 在 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)加入 250 l matrigel (bd, usa) 37c 孵育 1 小時(shí)形成膠體，聚合凝膠后將 轉(zhuǎn)染 4 小時(shí) 4104 rf/6a 細(xì)胞接種至小孔中，1% fbs、dmem 及 200 mol/l cocl2 孵育。 每組三孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。24 小時(shí)后,利用倒置相差顯微鏡觀察 matrigel 膠上二維血管 管腔形成的情況。每孔隨機(jī)選擇 5 個(gè)視野，adobe photoshop 7.0 計(jì)算新生血管管腔長度，用 每孔每個(gè)視野下生成血管平均總長度(mm)表示。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（sd）或平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤（se）表示。采用單因素方差分 析檢驗(yàn)(anova) ，mann-whiteney u test 和 independent-samples t-test。 顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 p005。利用 spss for windowsl3.0 軟件(spss inc., usa)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定觀察細(xì)胞形態(tài)，新鮮分離的血單個(gè)核細(xì)胞（pbmnc）呈圓形，35h 后即有細(xì)胞貼壁， 并伸出突起。第 3 天開始出現(xiàn)梭狀內(nèi)皮樣細(xì)胞，至第 5 天大部分貼壁細(xì)胞呈長梭狀內(nèi)皮樣生 長，至 7-9 天可觀察到皿底出現(xiàn)成簇生長的內(nèi)皮細(xì)胞集落。典型集落，周圍細(xì)胞呈放射狀排 列(圖 1)。培養(yǎng)的 rf/6a 細(xì)胞和血管性血友病因子免疫染色鑒定,胞漿呈紅色(圖 2)。圖 1 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞形成的集落 (40)fig.1 the colony of endothelial precursor cells (40)200205圖2 培養(yǎng)的rf/6a 細(xì)胞和細(xì)胞鑒定。a：亞融合狀態(tài)的rf/6a 細(xì)胞 (200); b:培養(yǎng)的rf/6a細(xì)胞血管性血友病因子免疫熒光染色(400)。fig. 2 cultured rf/6a cells and cell identification. a: subconfluent rf/6a cells (original magnification 200); b: immunofluorescent staining for von willebrand factor in cultured rf/6a cells. (original magnification 400).2.2 體外不同缺氧時(shí)間下 rf/6a 細(xì)胞 dll4 mrna 及其蛋白表達(dá)rf/6a 細(xì)胞暴露于缺氧條件 124 小時(shí)。在正常及缺氧下 dll4 mrna 及其基因均表達(dá)。 實(shí)時(shí)定量 pcr 結(jié)果顯示 dll4 mrna 于缺氧 1 小時(shí)開始表達(dá)，持續(xù) 24 小時(shí)，其峰值位于12 小時(shí)(圖 3)。實(shí)時(shí)定量 pcr 顯示在 1,6,12,24 小時(shí) dll4 mrna 表達(dá)呈 1.25-, 3.38-, 4.76-,2.95-倍增加。2106relative dll4 mrnaexpression ( fold )543210161224hypoxia time (hour)圖3 缺氧下rf/6a 細(xì)胞dll4 mrna表達(dá)定量分析fig.3 . expression of the dll4 mrna in rf/6a cells2152.3 dll4 sirna 對 dll4 mrna 及其蛋白表達(dá)水平的影響流式細(xì)胞儀顯示 dll4 sirna 經(jīng)過 48 小時(shí)轉(zhuǎn)染效率是 66.2% (圖 4 a)。缺氧培養(yǎng) 12小 時(shí)的 rf/6a 細(xì)胞的 dll4mrna 及蛋白表達(dá)的上調(diào)可被 dll4 sirna 明顯抑制(圖 4 b,c,d)。 dll4 sirna 可顯著降低 dll4 mrna 的表達(dá)水平。dll4 sirna-duplex1 和 sirna-duplex2 轉(zhuǎn)染組的 mrna 水平較 scrambled sirna 組分別降低 91.4% 和 82.5%, 蛋白水平則相應(yīng)降 低 86.2% 和 75.3% 。對 照組間 dll4 蛋白的表達(dá)無明顯 差異 (p=0.139) 。 dll4 sirna-duplex1 因其高效的基因沉默作用被用于下一步研究。a220abbdll4 337 bpgapdh 452 bp225cdll4 74 kdagapdh 38 kdad0.5relative dll4 pixel intensity(normalized to gapdh)0.10blank control trans fectiondll4 s irna- dll4 s irna-scrambledreagentduplex1duplex2control230235240245圖4 dll4 sirna顯著降低dll4 的mrna及蛋白表達(dá)水平。a:流式細(xì)胞儀檢測dll4 sirna轉(zhuǎn)染效率。(a) 空 白對照組(b) dll4 sirna轉(zhuǎn)染組。 b:pcr圖示dll4 sirna明顯抑制mrna表達(dá)。c:各組缺氧rf/6a細(xì)胞dll4 表 達(dá)的蛋白印跡分析圖。條帶1:空白對照組; 條帶2:轉(zhuǎn)染試劑組;條帶3: dll4 sirna-duplex1 組;條帶4: dll4 sirna-duplex2 組;條帶5:scrambled sirna 對照組。d: 各組相dll4蛋白的相對表達(dá)量。fig. 4 dll4 in sirna specifically knocks down dll4 mrna and protein levels. a: dll4 sirna transfection efficiency as determined by flow cytometry. (a) blank control group (b) dll4 sirna transfection group. b: dll4 sirna inhibited the mrna expression. c: a representative photograph of the western-blot analysis of dll4 expression in hypoxic rf/6a cells. 1: blank control group; 2: transfection reagent control group; 3: dll4sirna-duplex1 group; 4: dll4 sirna-duplex2 group; 5: scrambled sirna control group. d: the data of the relative dll4 protein.2.4 dll4 sirna 對缺氧下 epc 細(xì)胞增殖的影響mtt 結(jié)果見表 2。表 2 dll4 sirna 對缺氧下 epc 細(xì)胞增殖的影響tab.2 effect of the dll4 sirna on proliferation of hypoxic endothelial precursor cells時(shí)間 空白對照組 轉(zhuǎn)染試劑組 scrambled sirna 對照組 dll4 sirna-duplex1 組0h0.1390.0210.1330.0150.1460.0040.4780.02425024h48h0.2410.0030.3520.0110.2610.0220.2580.0060.2790.0190.3160.0330.6390.013 *0.9740.045 *255注：*p 0.052.5 dll4 sirna 對缺氧下 epc 細(xì)胞遷移的影響各組遷移結(jié)果見表 3。表 3 dll4 sirna 對缺氧下 epc 細(xì)胞遷移的影響tab.3 effect of the dll4 sirna on migration of hypoxic endothelial precursor cells260遷移細(xì)胞數(shù)目 空白對照組 轉(zhuǎn)染試劑組 scrambled sirna 對照組 dll4 sirna-duplex1 組（個(gè)）45.45.6 35.22.3 41.76.8 115.32.7 *注：*p 0.052652702.6 dll4 sirna 對缺氧狀態(tài)下 rf/6a 細(xì)胞 hes1 和 hey1 mrna 表達(dá)水平 的影響用逆轉(zhuǎn)錄-pcr 及實(shí)時(shí)定量 pcr 研究 dll4 sirna 對 dll4-notch-hes1-hey1 信號通 路中主要下游基因 hes1 和 hey1 的表達(dá)的影響。結(jié)果示：相對于 scrambled sirna 對照組, 下調(diào) 91.4%的 dll4 mrna 的表達(dá)導(dǎo)致 hes1 的 mrna 表達(dá)減少 75.1% (p=0.004)，hey1 的 mrna 表達(dá)減少 86.3% (p=0.004) (圖 5)。ad ll4 337 bphes1 271 bpgapdh 452 bp hey1 248 bp gapdh 452 bprelative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)b4.03.53.02.52.01.51.0 *0.5blanktransfe ction reagentscramble dduplex 1*2750.0hes1 hey1280285290圖 5 各組缺氧培養(yǎng)rf/6a細(xì)胞中hes1和hey1 mrna 的表達(dá)水平。a:pcr圖示各組hes1和hey1的mrna表達(dá)。條帶1: dll4 sirna-duplex1 組; 條帶2:scrambled sirna對照組;條帶3:轉(zhuǎn)染對照組;條帶4:空白對照組;條帶5: 缺氧0小時(shí)。b:各組rf/6a細(xì)胞中hes1和hey1 mrna 的表達(dá)量。將缺氧0小時(shí)的mrna表達(dá)作為基線對照， 其值設(shè)定為1。(較scrambled sirna對照組，*p 0.05)fig.5 mrna expression of hes1 and hey1 in rf/6a cells. a: rf/6a cells were exposed to 200m cocl2 for12h to achieve chemical hypoxia. lane 1: dll4 sirna-duplex1 group; lane 2: scrambled sirna control group;lane 3: transfection reagent control group; lane 4: blank control group；lane 5: hypoxic time 0h. b: the data of the mrna expression of hes1 and hey1. basal reference levels in control (hypoxic time 0 hour) are defined as 1.(*p 0.05 vs scrambled sirna control group).2.7 dll4 sirna 對缺氧狀態(tài)下 rf/6a 細(xì)胞周期進(jìn)程的影響細(xì)胞周期分析結(jié)果表明 dll4 的表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的 s 期(圖 6)。結(jié)果 顯示缺氧培養(yǎng) 96 小時(shí)，空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、scrambled sirna 組及 dll4 sirna 組 的 g0/g1 期細(xì)胞比例分別為(69.645.02)%、(70.174.96)%、(70.595.67)% 、(49.963.38)%。 各組 s 期細(xì)胞的比例分別為(12.091.21)%、(10.891.05)%、(11.371.12)%、(29.661.93)% 。rf/6a cell cycle distribution100 blank control transfection reagents crambled control dll4 sirna-duplex180 60 40 20 0go/g1 g2/m sstage295300圖 6 dll4 sirna對缺氧下rf/6a 細(xì)胞周期的影響fig 6 effect of the dll4 sirna on the cell-cycle progression of rf/6a cells2.8 dll4 sirna 對體外缺氧下 rf/6a 細(xì)胞遷移的影響如圖 7 所示，缺氧下 rf/6a 細(xì)胞遷移以跨過 transwell 室纖維膜細(xì)胞數(shù)目表示。缺氧 8 小時(shí)，dll4 sirna 組較 scrambled sirna 對照組 rf/6a 移行細(xì)胞數(shù)目增加 1.6 倍(p 0.001)。 對照組間遷移細(xì)胞數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.137)。abc35*30number of migrated cells2520151050blank control t ransfection reagent scrambled control dll4 sirna- duplex1 groups305310315320圖7 dll4 sirna對缺氧下rf/6a 細(xì)胞遷移的影響。a:scrambled sirna對照組的遷移細(xì)胞( 200)；b:dll4 sirna組的遷移細(xì)胞( 200)；c:各組遷移的跨膜細(xì)胞數(shù)目。fig.7 effect of the dll4 sirna on the migration of hypoxic rf/6a cells. a: migrated cells in the scrambled sirna control group (original magnification 200); b: migrated cells in the dll4 sirna group (original magnification 200). c: the number of migrated cells in each group .2.9 dll4 sirna 對缺氧下 rf/6a 細(xì)胞血管管腔形成的影響缺氧 24 小時(shí)各組 rf/6a 細(xì)胞血管管腔形成情況 (圖 8)。dll4 水平下調(diào)導(dǎo)致 matrigel 內(nèi)形成多而密集的網(wǎng)狀血管結(jié)構(gòu)，而空白對照組形成不完整的稀疏血管網(wǎng)絡(luò)。 用總血管長 度表示二維血管管腔形成情況，dll4 sirna 組較空白對照組形成增加(p 0.001)。而三個(gè)對 照組組間的血管管腔長度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.178)。ab6*5tube length , mm43210blank controltransfection reagentscrambled controldll4 sirna- duplex1groups325330圖8 dll4 sirna對缺氧下 rf/6a 細(xì)胞血管管腔形成的影響。a: rf/6a 細(xì)胞形成血管管腔的典型圖片。b:各組rf/6a 細(xì)胞形成血管管腔的平均總長度。fig.8 effect of the dll4 sirna on tube formation in hypoxic rf/6a cells. a: representative photograph of thetube formation in hypoxic rf/6a cells (bar = 100 um) . b: downregulation of dll4 expression in hypoxic rf/6a cells led to a significant increase in total tube length compared with the scrambled sirna control (*p 0.05). data were shown as meansd of triplicate wells in three independent experiment.3353403453503討論rf/6a 細(xì)胞是從健康雄性恒河猴提取的脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)，生長模式， 超微結(jié)構(gòu)以及免疫細(xì)胞化學(xué)證明其為脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞。用 rf/6a 細(xì)胞系研究脈絡(luò)膜內(nèi) 皮細(xì)胞被認(rèn)為是體外研究 cnv 相關(guān)疾病致病機(jī)制及治療的可靠模型。21,22cnv 是一個(gè)復(fù)雜過程，其中缺氧起重要作用3-7。200 mol/l 濃度 cocl2 可用來模擬缺 氧環(huán)境23。我們的研究利用 cocl2 形成的化學(xué)缺氧來觀察 rf/6a 細(xì)胞 dll4 的表達(dá)，以及 dll4sirna 對 epc 和 rf/6a 細(xì)胞血管生成包括細(xì)胞增殖，移行以及血管管腔形成的影響。 雖然 cocl2 形成的化學(xué)性缺氧與生理性缺氧不能完全等同，但