(精品論文)甘薯中主要水解酶同工酶特性研究畢業(yè)論文

目 錄 中文摘要1 英文摘要2 1 引言3 1.1 甘薯的研究意義3 1.2 三種主要水解酶3 1.2.1 淀粉酶.3 1.2.2 酯酶.4 1.2.3 蛋白酶.4 1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳6 1.4 實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容7 2 材料與方法8 2.1 材料與試劑.8 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料8 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑8 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器8 2.2 實(shí)驗(yàn)方法.8 2.2.1 材料的預(yù)處理及培養(yǎng)8 2.2.2 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的大致流程8 2.3 粗酶液的制取.8 2.4 PAGE 電泳 9 2.5 水解酶同工酶染色9 2.5.1 淀粉酶同工酶染色9 2.5.2 酯酶同工酶染色9 2.5.3 蛋白水解酶同工酶染色9 2.6 溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響.9 2.7 淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)9 2.8 pH 對(duì)淀粉酶同工酶的影響9 2.9 淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)10 2.10 淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn).10 3 結(jié)果與分析11 3.1 發(fā)芽 7 天的甘薯不同部位的淀粉酶電泳分析11 3.1.1 發(fā)芽 7 天的甘薯“北京 553”不同部位的淀粉酶電泳分析.11 3.1.2 發(fā)芽 7 天的甘薯“徐薯 18”不同部位的淀粉酶電泳分析.11 3.2 不同品種甘薯中淀粉酶電泳圖譜比較.12 3.3 溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響.13 3.3.1 溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響.13 3.3.2 溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影響.14 3.4 淀粉酶同工酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).15 3.4.1 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)15 3.4.2 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)16 3.5 甘薯“徐薯 18”淀粉酶活性存在的 pH 值范圍 17 3.5.1 淀粉酶活性存在的極低 pH 值17 3.5.2 淀粉酶活性存在的極高 pH 值17 3.6 pH 對(duì)淀粉酶同工酶的影響18 3.6.1 pH 對(duì)發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響 18 3.6.2 pH 值對(duì)發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影響 19 3.7 淀粉酶同工酶的 pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)20 3.7.1 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) .20 3.7.2 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) .20 3.8 淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子的敏感性.21 3.8.1 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn)21 3.8.2 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn).22 3.9 酯酶同工酶酶譜分析.22 3.10 蛋白水解酶同工酶酶譜分析.23 4 討論25 5 結(jié)論28 謝辭29 參考文獻(xiàn)30 第 1 頁(yè) 共 31 頁(yè) 甘薯中主要水解酶同工酶特性研究甘薯中主要水解酶同工酶特性研究 摘要：摘要：本實(shí)驗(yàn)以兩種不同品種的甘薯（“北京 553”和“徐薯 18”）為材料，采用 聚丙烯酰胺凝膠活性電泳方法，對(duì)發(fā)芽過(guò)程中甘薯的淀粉酶、酯酶和蛋白酶三 大水解酶進(jìn)行了研究；同時(shí)研究了溫度、pH 值和金屬離子對(duì)甘薯淀粉酶活性的 影響以及酶的熱穩(wěn)定性和 pH 穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，甘薯根和芽中酶含量很低， 而莖中酶含量較高。甘薯淀粉酶最適溫度為 40，在 060溫度條件下其 穩(wěn)定性較好；最適 pH 值在 pH5.2pH6.5 之間，而在 pH3.0pH8.0 之間酶具 有較強(qiáng)的穩(wěn)定性；Ca2+不影響淀粉酶同工酶活性，Zn2+和 Cu2+對(duì)淀粉酶同工酶 活性的抑制作用較小，Pb2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用相對(duì)較大，而 Hg2+ 對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用最大，幾乎抑制了該同工酶的全部活性。進(jìn)一 步研究發(fā)現(xiàn)，不同品種甘薯淀粉酶同工酶的最適 pH 值有所差異，甘薯“徐薯 18”的最適 pH 大約為 5.4；而“北京 553”的最適 pH 大約為 6.2。此外，本實(shí)驗(yàn)還 發(fā)現(xiàn)，不同品種甘薯淀粉酶同工酶對(duì) pH 值的敏感性不同。甘薯“北京 553”淀粉 酶在 pH2.0pH9.0 都存在活性，而“徐薯 18”淀粉酶只在 pH4.0pH8.0 才存在 活性，表明與“北京 553”相比， “徐薯 18”的淀粉酶對(duì)環(huán)境 pH 值更敏感。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：甘薯；淀粉酶；酯酶；蛋白酶 第 2 頁(yè) 共 31 頁(yè) Study on the characteristics of the major hydrolysis iso-enzymes in sweet potato Abstract：The properties of amylase, esterase and protease were studied by means of PAGE native electrophoresis during the process of germination of two kinds of sweet potatoes i.e. Beijng 553 and Xushu 18. The effects of temperature, pH value, metal ions on the activities of amylase and its stability under certain temperature and pH value were investigated. The studies showed that the content of amylase was higher in stems than that of in roots and buds. The optimism temperature of amylase in sweet potatoes was 40 and its stability was well kept between 0-60. The optimism pH value of amylase was between pH5.2-pH6.5 and amylase was relatively stable between pH3.0pH8.0. The activities of amylase isozymes could not be affected by Ca2+ while were inhibited by Zn2+ and Cu2+ slightly and were inhibited by Hg2+ severely and were absolutely deprived by Hg2+. The further study showed that isozymes of amylase in different kinds of sweet potatoes appeared different optimism pH value. The optimism pH value of Xushu 18 was 5.4 while Beijing 553 pH 6.2. Besides, it was discovered that different kinds of sweet potatoes showed different sensitivities to pH value. Amylase in Beijing 553 kept its activity between pH2.0 pH9.0 while amylase in Xushu 18 was stable between pH4.0pH8.0. Compared with Beijing 553, amylase in Xushu 18 showed higher sensitivity to environmental pH value. Keywords: sweet potato; amylase; esterase; protease 第 3 頁(yè) 共 31 頁(yè) 1 引言引言 1.1 甘薯的研究意義甘薯的研究意義 甘薯(Ipomoeabatataslam)又名紅薯、白薯、紅芋、甜薯、地瓜等, 是高產(chǎn)糧 食作物。甘薯營(yíng)養(yǎng)豐富，具有醫(yī)療保健作用。關(guān)于甘薯的保健作用除了因其含 有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和具有一定的保健作用外,近 10 多年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)甘薯的 醫(yī)療保健功能也做了不少的研究,一致認(rèn)為甘薯對(duì)人體具有保健功能,尤其是在抗 突變功能和血液病的治療作用方面尤為突出1。 有關(guān)于甘薯的醫(yī)療保健作用的報(bào)道如下:1.抗癌癥功能；2.增強(qiáng)免疫功能；3. 降血脂、降膽固醇功能；4. 抗突變體；5. 增強(qiáng)血小板功能；6. 抗衰老,延長(zhǎng)壽 命1。 甘薯除了供人們食用和作為保健食品外，同時(shí)也是工業(yè)生產(chǎn)的重要原料。 甘薯含有大量的淀粉和糖類（含麥芽糖、葡萄糖等） ，還含蛋白質(zhì)、脂肪、維生 素等2。具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。甘薯中含有大量的淀粉酶（以 -淀粉酶為主） ， 同時(shí)也含有蛋白酶和酯酶。其中的 -淀粉酶又稱淀粉-1,4-麥芽糖苷酶,它被廣泛 應(yīng)用于飴糖、啤酒和高麥芽糖的生產(chǎn)中3。尤其是啤酒生產(chǎn)工業(yè)，對(duì) -淀粉酶 的需求量非常大。-淀粉酶在甘薯中的含量很高，但是，由于目前國(guó)內(nèi)外在對(duì) 甘薯以及甘薯中主要水解酶同工酶的特性研究這方面做得還比較少，以至甘薯 中潛在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和巨大商機(jī)還未得到充分開(kāi)發(fā)。另一方面，在甘薯淀粉的生 產(chǎn)過(guò)程中，含 -淀粉酶的廢水均未充分利用。既浪費(fèi)了 -淀粉酶資源,又造成嚴(yán) 重的環(huán)境污染.。 伴隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。結(jié)合到我們的實(shí)驗(yàn)研究 來(lái)說(shuō)，假如我們能在甘薯及其所含主要水解酶同工酶特性研究方面取得較大的 進(jìn)展。那么，我們就有可能將甘薯淀粉的生產(chǎn)、-淀粉酶的提取以及對(duì)淀粉生 產(chǎn)工業(yè)中所產(chǎn)生廢液的處理（環(huán)境保護(hù)問(wèn)題） 、啤酒生產(chǎn)、飴糖生產(chǎn)、高麥芽糖 生產(chǎn)聯(lián)合起來(lái)，形成一條連鎖的生產(chǎn)、處理線，使其成為一個(gè)有機(jī)的統(tǒng)一的一 體化流程。相信會(huì)帶來(lái)不小的商業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值！ 1.2 三種主要水解酶三種主要水解酶 酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物,酶的遺傳和表達(dá)遵循著孟德?tīng)柖伞Ｍっ讣葦y帶著 遺傳信息,又可以通過(guò)特有的生化活性被方便地檢出,因此同工酶作為基因的標(biāo)志,可 反映機(jī)體的某些遺傳信息。 1.2.1 淀粉酶淀粉酶 淀粉酶包括 -淀粉酶和 -淀粉酶。-淀粉酶是一種內(nèi)切酶，而 -淀粉酶則 是一種外切酶。-淀粉酶作用底物的效率相對(duì)較低，與 -淀粉酶相比，-淀粉 第 4 頁(yè) 共 31 頁(yè) 酶作用底物的效率相對(duì)較高。從進(jìn)化的角度來(lái)推測(cè)，作用于同一底物的同工酶 或同一類酶，外切酶應(yīng)該具有更為古老的進(jìn)化背景，-淀粉酶的起源是否先于 -淀粉酶，目前還不能確定。但是，-淀粉酶的起源先于 -淀粉酶這種可能性 要遠(yuǎn)大于 -淀粉酶的起源先于 -淀粉酶或兩者同時(shí)出現(xiàn)的可能性。因?yàn)閺倪M(jìn)化 的角度來(lái)看，生物界的作用方式總是從簡(jiǎn)單到復(fù)雜。與 -淀粉酶不同，-淀粉 酶在萌發(fā)過(guò)程中大多是從頭合成的（de novo） 。據(jù)實(shí)驗(yàn)所獲知，-淀粉酶總是在 萌發(fā)后期才大量出現(xiàn)，而在很多種子中卻存在著現(xiàn)成的 -淀粉酶。當(dāng)前為大家 所接受的理論認(rèn)為，是 -淀粉酶首先直接水解完整的淀粉粒，釋放糊精，然后 在 -淀粉酶、脫支酶、-葡萄糖苷酶的作用下將其水解為麥芽糖和葡萄糖。在 這種理論下，現(xiàn)成的 -淀粉酶的存在意義就不大了，因?yàn)橛行┓N子可以從頭合 成 -淀粉酶（如水稻） 。大量研究表明，-淀粉酶和 -淀粉酶在種子萌發(fā)過(guò)程中 淀粉的完全水解起著不同的生理生化功能。-淀粉酶對(duì)淀粉的作用與 -淀粉酶 相比，具有不同的幾點(diǎn)：-淀粉酶降解淀粉時(shí)，基本上不進(jìn)行液化，僅僅增加 還原性；作為一種還原性物質(zhì)，不生成葡萄糖而只生成麥芽糖；由奇數(shù)葡萄糖 殘基構(gòu)成的直鏈部分，最后除麥芽糖外，可生成麥芽三糖（三個(gè)葡萄糖殘基呈 -1，4 結(jié)合的三糖） 。普通的淀粉可被 -淀粉酶分解 60%左右。-淀粉酶和 -淀 粉酶分解淀粉型種子中的淀粉，從分解速度來(lái)看，在自然狀態(tài)下參與淀粉分解 的酶也主要是 -淀粉酶，-淀粉酶只起輔助作用。-淀粉酶除了在發(fā)酵、制糖 等工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用外，也是酶的多態(tài)性、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、同工酶不同 表達(dá)等基礎(chǔ)研究的模式酶4。 有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)對(duì)甘薯皮、心層的 -淀粉酶進(jìn)行提取測(cè)定,得知皮層中酶的含量 比心層高。對(duì)混合酶液先進(jìn)行純化,再對(duì)粗、純酶液的熱、酸堿穩(wěn)定性分析,結(jié)果 表明:粗酶液最適反應(yīng)溫度為 55,在 50-60間較穩(wěn)定;最適 pH 值 6.0,在 pH 值 為 4.0-9.0 間較穩(wěn)定。純酶液最適反應(yīng)溫度和 pH 值與粗酶液一樣,但沒(méi)有時(shí)段溫 度穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。粗、純酶液在強(qiáng)酸堿條件下,失活很快5。 1.2.2 酯酶酯酶 酯酶同工酶(Esteraseisozymes)是一組能水解酯鍵的酶,在生物體內(nèi)廣泛存在。 許多實(shí)驗(yàn)證明,它在種系的鑒定中具有很重要的參考價(jià)值。近年來(lái),利用酯酶同工 酶進(jìn)行昆蟲(chóng)分類鑒定、研究系統(tǒng)發(fā)育等日漸增多。很多研究證明,酯酶同工酶在 較低階元中具有分類鑒別特征6。 酯酶存在于植物各個(gè)部位和不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞中,主要分布在細(xì)胞質(zhì)的球 粒內(nèi)。酯酶的變化在植物的代謝調(diào)節(jié)上有重要作用,它能催化羧酸酯類的水解,在 代謝中可能有轉(zhuǎn)酯作用。酯酶同工酶與植物的抗逆性也有關(guān)。不同發(fā)育時(shí)期的 同工酶具有顯著的差異性,可以反映出生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的情況.因而,可 以把同工酶酶譜作為植物發(fā)育的指標(biāo),用于植物分類、親緣起源關(guān)系等方面的研 第 5 頁(yè) 共 31 頁(yè) 究。 1.2.3 蛋白酶蛋白酶 蛋白酶同工酶中的半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白酶家族,廣泛參與植物 的各種生理過(guò)程。許多研究表明在環(huán)境脅迫如低溫、干旱和鹽脅迫條件下半胱 氨酸蛋白酶 mRNA 會(huì)累積7，8。而在植物某些涉及細(xì)胞程序化死亡的發(fā)育階段 中,半胱氨酸蛋白酶 mRNA 含量也會(huì)增加,這表明半胱氨酸蛋白酶與植物細(xì)胞程 序化死亡有關(guān)9。半胱氨酸蛋白酶也存在于葉綠體和液泡中,可降解光合作用必 需酶 Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖脫羧/加氧酶)的大亞基,在遭 受水分脅迫而衰老 的植物葉片中,半胱氨酸蛋白酶起著主要作用10。此外,在植物的正常發(fā)育過(guò)程 中,半胱氨酸蛋白酶可動(dòng)員貯存蛋白,實(shí)現(xiàn)氮素的再利用,以供種子萌發(fā)之需,而在 植物特異組織的形成,如木質(zhì)部分化和通氣組織形成等過(guò)程中也有半胱氨酸蛋白 酶的參與。 許多葉綠體蛋白，如 Rubisco 的 SSU，質(zhì)體藍(lán)素，鐵氧還蛋白 NADP 氧化 還原酶和內(nèi)膜磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)因子等，在細(xì)胞質(zhì)中是較大的分子質(zhì)量（2，000 15，000）前體，合成轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，被間質(zhì)蛋白酶重新修飾、裝配成成熟的 蛋白質(zhì)11。關(guān)于葉綠體中的加工修飾酶的研究報(bào)道比較少，或許是由于它們?cè)?葉綠體中的含量較低，不易被分離和純化的緣故。最近，Oblong 等研究發(fā)現(xiàn)葉 綠體中有一種加工修飾酶，它能對(duì) CAB 和兩種 145KD 的蛋白前體進(jìn)行加工12。 基因序列分析的結(jié)果表明，它與微生物的金屬蛋白酶家族具有較高的同源性， 有典型的鋅結(jié)合基序（motif） 。核基因編碼的、定位于類囊體腔的蛋白，需要 經(jīng)過(guò)兩次加工修飾，第二次加工是由一種定位于類囊體膜上的蛋白酶來(lái)完成的 13。目前，關(guān)于 D1 蛋白前體的加工修飾，取得了令人欣慰的進(jìn)展。Anbudurai 等在這方面做了大量的研究工作14。他首先在產(chǎn)氰的集胞藻 6803 中發(fā)現(xiàn)了一 個(gè)新的 ctpA 基因，然后在研究其功能中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)該基因失活時(shí)，水氧化反應(yīng)受 到削弱，D1 蛋白前體在膜上大量累積，而 PSII 復(fù)合體的其它亞基不受影響。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因的產(chǎn)物是一種分子量為 43KD 的蛋白水解酶，能夠?qū)?D1 蛋白前體 C 末端一段氨基酸序列去掉，使得 D1 蛋白成熟。Fujita 等15純化了該 酶，氨基酸序列分析的結(jié)果表明，該酶與大腸桿菌中的一種 C 末端加工酶 （TSP）同源性較高。研究表明，TSP 通過(guò) C 末端的某種特征來(lái)識(shí)別目標(biāo)蛋白， 然后在特定位點(diǎn)去掉 C 末端序列。葉綠體中的這種末端加工酶是否也具有相類 似的機(jī)制，還有待進(jìn)一步的研究。 近年來(lái)，在葉綠體蛋白水解酶的研究中，有令人激動(dòng)的發(fā)現(xiàn)：許多葉綠體 蛋白水解酶與細(xì)菌蛋白水解酶具有很高的同源性。目前，這方面的研究主要集 中于 ClpAP 蛋白水解酶。ClpAP 是在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)的，它是一種依賴 ATP 的、絲氨酸蛋白水解酶，由兩種亞基組成：21KD 的 ClpP 亞基，具有蛋白 第 6 頁(yè) 共 31 頁(yè) 水解酶的活性；81KD 的 ClpA 亞基，具有 ATP 酶的活性16，17。通過(guò)電鏡觀察 和衍射圖譜分析，ClpAP 由多拷貝的兩種亞基結(jié)合在一起，形成一個(gè)大的 （700KD） 、可溶的間質(zhì)蛋白復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)與真核生物的蛋白酶體很相似18。 關(guān)于葉綠體中的 ClpAP 的發(fā)現(xiàn)，Gray 等將小麥葉綠體 DNA 的一段開(kāi)放性閱讀 框與大腸桿菌的 ClpP 基因進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其有很高的同源性19。同時(shí)， Gottesman 等也發(fā)現(xiàn)，番茄的核基因上有一段序列與 ClpA 亞基的基因有較好的 同源性20。另外， Moore 等又發(fā)現(xiàn)，ClpP 的全長(zhǎng) CDNA 克隆，能被轉(zhuǎn)運(yùn)到離 體的葉綠體中。生化和免疫學(xué)方面的研究均表明，ClpAP 定位于葉綠體間質(zhì)中。 另外，在許多植物的葉綠體中都發(fā)現(xiàn)有 ClpAP 蛋白水解酶21。另外一種細(xì)菌蛋 白水解酶的同系物是 FtsH22,它是一種依賴 ATP 的，需 Zn2+的金屬蛋白酶23， 其生理功能尚不清楚。但目前的研究認(rèn)為，它可能和 ClpAP 一樣，也是清除葉 綠體中不正常的蛋白22。與 ClpAP 不同的是，F(xiàn)tsH 是一種膜蛋白，結(jié)構(gòu)上具有 公認(rèn)的跨膜螺旋，暴露于基質(zhì)中的 74KD 蛋白是它的功能域23。Kuwabara 等從 富含 PSII 的膜上，純化得到兩種蛋白水解酶。一種含有 4 個(gè)相同的亞基，分子 量為 39KD，常用的蛋白酶抑制劑對(duì)其沒(méi)有抑制作用，而 DTT 卻強(qiáng)烈的抑制其 活性，它能降解與光合水氧化有關(guān)的 16KD 蛋白。另一種，對(duì) DTT 不敏感，它 也能降解 16KD 蛋白，作用位點(diǎn)位于該蛋白 N-末端的脯氨酸的殘基所形成的肽 鍵24。如果 16KD 的蛋白是這兩種蛋白水解酶的生理底物，那么這兩種蛋白水 解酶都應(yīng)該定位于類囊體腔中。另外，綠藻中有一種能夠降解 CAB 的蛋白水解 酶25；菠菜中有一種 43KD 的金屬蛋白酶26。 1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠是通過(guò)丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis） 在一個(gè)適當(dāng)?shù)挠坞x基催化的作用下共聚而成的高分子多孔化合物。常用的聚合 方法有化學(xué)聚合和光聚合兩種，化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨（AP） ， 此外，還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，常用的加速劑為四甲基乙二胺 （TEMED） 。聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)孔大小與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度有 關(guān)。此外，凝膠的機(jī)械性、彈性、透明度、黏著度等也與丙烯酰胺和甲叉雙丙 烯酰胺的比例有關(guān)。 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）普遍運(yùn)用于分 離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。其基本方式有兩種：圓盤電泳（disc- electrophoresis）和平板電泳（slab-electrophoresis） 。不論圓盤電泳或平板電泳都 有連續(xù)和不連續(xù)電泳之分。電泳在電極緩沖液、凝膠緩沖液、凝膠孔徑一致的 體系中進(jìn)行，稱為連續(xù) PAGE；電泳在電極緩沖液、凝膠緩沖液 pH 不同、凝膠 孔徑不同的體系中進(jìn)行，稱為不連續(xù) PAGE。不連續(xù) PAGE 分離中包括 3 種物 理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。而連續(xù) PAGE 第 7 頁(yè) 共 31 頁(yè) 則不具備濃縮效應(yīng)27。 在不連續(xù) PAGE 中，由于電泳基質(zhì)的不連續(xù)，使樣品在濃縮膠層中得以濃 縮，然后到達(dá)分離膠層得以分離。電泳凝膠分兩層，上層是大孔徑的濃縮膠 （凝膠濃度?。?，下層是小孔徑的分離膠（凝膠濃度大） 。蛋白質(zhì)分子在大孔徑 凝膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔徑凝膠后受到的阻力大，移動(dòng)速 度減慢27。在緩沖體系中存在 3 種不同的離子，第一種離子在電泳中具有較大 的遷移率走在最前面，這種離子是前導(dǎo)離子（leading ion） ；另一種遷移率較小 的與前導(dǎo)離子帶有相同電荷的離子是尾隨離子（tracking ion） ；第三種是緩沖平 衡離子（buffer counter ion） 。前導(dǎo)離子存在于凝膠中，尾隨離子存在于電極緩 沖液中，而緩沖平衡離子在凝膠和電極緩沖液中均有。如電泳法分離蛋白質(zhì)時(shí)， 氯離子（Cl-）是前導(dǎo)離子，甘氨酸離子是尾隨離子（NH2CH2COO-） ，三羥甲基 氨基甲烷（Tris）是緩沖平衡離子。電泳開(kāi)始后，在濃縮膠和電極緩沖液的界 面上，前導(dǎo)離子快速離開(kāi)尾隨離子向下移動(dòng)，在選擇適當(dāng)?shù)?pH 緩沖液，使蛋 白質(zhì)的有效遷移率介于前導(dǎo)離子和尾隨離子之間，從而濃縮成較窄的區(qū)帶27。 電泳開(kāi)始后，電位梯度的大小將影響電泳速度，由于前導(dǎo)離子的遷移率大，則 在其后就形成一個(gè)低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電位梯度成反比，因此，這種低電導(dǎo)區(qū)就 產(chǎn)生了較高的電位梯度，使蛋白質(zhì)和尾隨離子在前導(dǎo)離子后面加速移動(dòng)，因而 在低電位梯度和高電位梯度之間形成一個(gè)迅速移動(dòng)的界面。由于蛋白質(zhì)的有效 遷移率介于前導(dǎo)離子和尾隨離子之間，因此被濃縮成一條狹小的樣品薄層。在 濃縮膠和分離膠之間有 pH 值的不連續(xù)，這是為了控制尾隨離子的解離，即控 制其遷移率，使樣品在前導(dǎo)離子和尾隨離子之間被濃縮。蛋白質(zhì)在濃縮膠層中 被高度濃縮，形成高度濃縮的蛋白質(zhì)區(qū)。加上每種蛋白質(zhì)分子大小和所帶電荷 的不同，故電泳速度不同，這樣各種蛋白質(zhì)就以一定的順序排列成蛋白質(zhì)區(qū)帶。 在濃縮膠層得到濃縮的蛋白質(zhì)區(qū)帶逐漸泳動(dòng)到達(dá)分離膠層。由于分離膠層凝膠 濃度大，分子篩孔小，蛋白質(zhì)將受到凝膠的阻力作用。分子量大且不規(guī)則的分 子所受阻力大，泳動(dòng)速度慢；反之，分子量小且形狀為球形的分子所受阻力小， 泳動(dòng)速度快。這樣，分子形狀和大小不同的各組分在分離膠層中得到分離27。 1.4 實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容 前人有的對(duì)淀粉酶同工酶特性進(jìn)行了研究，有的對(duì)酯酶作了適當(dāng)研究，有 的對(duì)蛋白酶進(jìn)行了一些研究。但是，目前還尚未見(jiàn)到對(duì)植物中的淀粉酶、酯酶 和蛋白酶三大水解酶特性的整體性研究。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)就以甘薯為材料，采 用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法中的不連續(xù)電泳法，以研究甘薯發(fā)芽后其芽、根、 莖中的淀粉酶、酯酶和蛋白水解酶三大水解酶的特性為目的。實(shí)驗(yàn)研究了酶的 熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和溫度、pH 值以及金屬離子對(duì)酶活性的影響。 第 8 頁(yè) 共 31 頁(yè) 2 材料與方法材料與方法 2.1 材料與試劑材料與試劑 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 兩個(gè)甘薯品種：徐薯 18 與北京 553 材料由國(guó)家甘薯研究中心提供。 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)試劑 丙烯酰胺（Acr） ，甲叉雙丙烯酰胺（Bis） ，過(guò)硫酸銨（AP） ，四甲基乙二 胺（TEMED） ，醋酸-1-萘酯，-醋酸萘酯，固鹽 B，可溶性淀粉， NaOH，NaAc，NaCl，CaCl2，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，醋酸鉀，酒石酸鉀鈉， 對(duì)硝基酚磷酸鈉，HCl，乙醇，甲醛，草酸，酚酞，0.1%HgCl2溶液，I2-KI 溶 液，Tris-HCl 50 mmol/L（pH 7.0） ，PVP，2-mercaptoethanol，3,5-二硝基水楊酸， 磷酸-檸檬酸，50 mmol/L 檸檬酸緩沖溶液 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器 光照培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，分析天平（1 臺(tái)） ，研缽（2 套） ，石英砂，封 口膜，細(xì)線，電爐，石棉網(wǎng)，洗瓶，垂直電泳槽（2 套） ，電泳儀，pH 精密試 紙，離心機(jī)，離心管，濾紙，鑷子，試管架，鐵架臺(tái)，洗耳球，培養(yǎng)皿（若干） ， 試管（若干） ，移液管，吸管，燒杯，玻璃棒，容量瓶，量筒，試劑瓶，錐形瓶 （若干） ，滴定管 2.2 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 材料的預(yù)處理及培養(yǎng)材料的預(yù)處理及培養(yǎng) 取“徐薯 18”和“北京 553”甘薯薯塊自來(lái)水沖洗干凈，用 0.1%HgCl2溶 液表面消毒 3 min，水沖洗 3-5 次后，置于裝有 50 mL 自來(lái)水的直徑 15 cm 大培 養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱（溫度 25，光照 16 h，光照度 300 umol m-2s-1，暗培 養(yǎng) 8 h）中培養(yǎng)并使其發(fā)芽。 2.2.2 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的大致流程實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的大致流程 甘薯材料的消毒光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)取樣冰浴研磨4高速冷凍離心 提取粗酶液活性電泳染色結(jié)果分析討論 2.3 粗酶液的制取粗酶液的制取 取未發(fā)芽的甘薯塊莖以及發(fā)芽后的甘薯的芽和塊莖各 2 g，放入研缽中， 加入 3 mL 提取液（50 mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖溶液，pH 7.5,1%PVP,2- 第 9 頁(yè) 共 31 頁(yè) mercaptoethanol 5 mmol/L）于冰浴上（0）充分研磨，待研磨至勻漿后，轉(zhuǎn)入 離心管，12000 r/min， 4離心 30 min 后，取其上清液即為粗酶液。稱取 0.1 g 蔗糖于裝樣管中，再加入 0.5 mL 原粗酶液于其中并混合均勻，使蔗糖充分溶 解于粗酶液中，備用。 2.4 PAGE 電泳電泳 參照何忠效的方法，按常規(guī)制備 T=7.5%的分離膠(pH=7.8)和 T=4%濃縮膠 (pH=6.7)的垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)凝膠。以 0.05%的溴芬藍(lán)染料做染色前沿，取經(jīng) 處理后的粗酶液 20 ul 上樣進(jìn)行電泳。 2.5 水解酶同工酶染色水解酶同工酶染色 2.5.1 淀粉酶同工酶染色淀粉酶同工酶染色 稱取 2 g 可溶性淀粉倒入小燒杯中，再加入少量相應(yīng) pH 值的緩沖溶液將 其制成懸濁液，將 200 mL 同樣的緩沖溶液倒入 500 mL 燒杯中并于電爐上加熱 至沸騰，取下，然后將淀粉懸濁液倒入已經(jīng)沸騰過(guò)的緩沖溶液中，并快速搖動(dòng)， 趁熱將淀粉溶解而配制成濃度為 1%的淀粉溶液。將凝膠置于 1%淀粉溶液中， 37保溫 15 min,蒸餾水洗去多余的淀粉，5%醋酸浸泡 5 min，然后置于 I2-KI 染液(每升溶液含 30g KI, 13g I2)顯色,在暗藍(lán)色的背景下顯示透明的區(qū)帶28。 2.5.2 酯酶同工酶染色酯酶同工酶染色 取 0.06g -醋酸萘酯，0.06g -醋酸萘酯，0.06g 固藍(lán)鹽 B，少許丙酮溶解， 加 0.067 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.5)至體積 40 ml，配成酯酶染色液(臨用現(xiàn)配),將 膠板置于染色液中,37保溫 60 min。染色后的膠板用蒸餾水沖洗，置于 5%醋 酸中保存28。 2.5.3 蛋白水解酶同工酶染色蛋白水解酶同工酶染色 將終濃度為 0.05%的血紅蛋白溶液配入 7.5%的分離膠中，于 4溫度條件 下電泳，電泳結(jié)束后，將膠移入 pH 5.2 的醋酸反應(yīng)緩沖液中，37恒溫 2 h 后 取出，用 0.1%氨基黑染色，其中亮帶即為蛋白水解酶消化帶。 2.6 溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響 將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡在溫度分別為 0，20，40，50，60， 70的 PBS 緩沖液中（50103 mol/L，pH 7.0，含 1%的可溶性淀粉） ，恒溫水 浴 15 min 后，蒸餾水快速?zèng)_洗，然后再分別在相對(duì)應(yīng)的溫度下，pH 7.0 的相同 PBS 緩沖液中恒溫水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.7 淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡在溫度分別為 0，25，45， 60，70， 第 10 頁(yè) 共 31 頁(yè) 80的 PBS 緩沖液中（50103 mol/L，pH 7.0） ，預(yù)處理 30 min，水洗 3 次，置 于 50103 mol/L PBS 緩沖液中（pH 7.0，含 1%的可溶性淀粉） ，37恒溫水浴 15 min 后，水洗三次，再分別置于 pH 7.0 的相同 PBS 緩沖液（不含淀粉）中 37恒溫水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.8 pH 對(duì)淀粉酶同工酶的影響對(duì)淀粉酶同工酶的影響 將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡在 pH 分別為 3.0，3.5，4.5，5.5，6.5，7.0，8.0，9.0 的緩沖液中（含 1%的可溶性淀粉） ， 37恒溫水浴 15 min 后，水洗三次，然后再分別置于相對(duì)應(yīng)的 pH 緩沖液（不 含淀粉）中 37恒溫水浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 2.9 淀粉酶同工酶對(duì)淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡在 pH 分別為 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 的緩沖液中，37恒 溫水浴處理 30 min，水洗三次后，置于 50103 mol/L PBS 緩沖液中（pH 7.0， 含 1%的可溶性淀粉） ，37恒溫水浴 15 min 后，水洗三次，然后再分別置于 pH 7.0 的相同 PBS 緩沖液（不含淀粉）中 37恒溫水浴 5 min 后，取出，碘液 染色28。 2.10 淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn) 將電泳結(jié)束后的凝膠分別浸泡在含有不同抑制劑（CaCl2,Zn SO4,CuSO4,Pb(NO3)2與 HgCl2）的 PBS 緩沖液中（50103 mol/L，pH 7.0） ， 37恒溫水浴預(yù)處理 30 min，水洗三次后，置于另加 1%的可溶性淀粉的上述緩 沖液（pH 7.0，分別含有上述各種抑制劑）中，37恒溫水浴 15 min 后，水洗 三次，然后再分別置于 pH 7.0 的相同 PBS 緩沖液（不含淀粉）中 37恒溫水 浴 5 min 后，取出，碘液染色28。 第 11 頁(yè) 共 31 頁(yè) 3 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 3.1 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的甘薯不同部位的淀粉酶電泳分析天的甘薯不同部位的淀粉酶電泳分析 3.1.1 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的甘薯天的甘薯“北京北京 553”不同部位的淀粉酶電泳分析不同部位的淀粉酶電泳分析 圖圖 3.1 發(fā)芽 7 天的甘薯“北京 553”不同部位的 -淀粉酶電泳 1 莖酶液；2 根酶液；3 芽酶液 如圖 3.1 所示，圖中“1”號(hào)、 “2”號(hào)和“3”號(hào)加樣孔加樣分別為發(fā)芽 7 天的甘 薯“北京 553”的莖提取酶液、根提取酶液和芽提取酶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萌發(fā) 后的甘薯“北京 553”的莖中含有大量淀粉酶，而其根和芽中幾乎不含有淀粉酶。 由圖 1 中的 5 條莖酶液電泳譜帶得知，發(fā)芽 7 天的甘薯“北京 553”的莖中含有 5 種淀粉酶同工酶。 3.1.2 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的甘薯天的甘薯“徐薯徐薯 18”不同部位的淀粉酶電泳分析不同部位的淀粉酶電泳分析 第 12 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.2 發(fā)芽 7 天的甘薯“徐薯 18”不同部位的淀粉酶電泳 1 根酶液；2 芽酶液；3 莖酶液 如圖 3.2 所示，圖中“1”號(hào)、 “2”號(hào)和“3”號(hào)加樣孔加樣分別為發(fā)芽 7 天的甘 薯“徐薯 18”的根、芽和莖提取酶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)芽 7 天后的甘薯“徐薯 18”的莖中含有大量淀粉酶，而其根和芽中幾乎不含有淀粉酶。由莖酶液電泳圖 譜的一條譜帶可獲知，莖中只有一種淀粉酶活性占主要優(yōu)勢(shì)。 3.2 不同品種甘薯中淀粉酶電泳圖譜比較不同品種甘薯中淀粉酶電泳圖譜比較 第 13 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.3 發(fā)芽 7 天的不同品種甘薯中淀粉酶電泳 1 “徐薯 18” 淀粉酶液；2 “北京 553” 淀粉酶液 如圖 3.3 所示，圖中“1”號(hào)和“2”號(hào)加樣孔加樣分別為甘薯“徐薯 18”淀粉酶 提取液和“北京 553”淀粉酶提取液。圖 3.3 所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：“北京 553”淀粉 酶電泳譜帶比“徐薯 18”淀粉酶電泳譜帶更寬大，說(shuō)明在相同的稀釋倍數(shù)條件下， “北京 553”淀粉酶活性比“徐薯 18”淀粉酶活性更強(qiáng)。 “徐薯 18”淀粉酶電泳譜帶的 相對(duì)遷移率更大，說(shuō)明其酶分子量更小一些。 3.3 溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響溫度對(duì)淀粉酶同工酶的影響 3.3.1 溫度對(duì)發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響淀粉酶同工酶的影響 第 14 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.4 溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響 不同溫度下的“徐薯 18”淀粉酶同工酶譜帶如圖 3.4 所示。從圖中可以看出： 在 0條件下， “徐薯 18”淀粉酶活性喪失；在 40時(shí)“徐薯 18”淀粉酶活性最強(qiáng)， 即最適溫度為 40。而當(dāng)溫度上升到 60時(shí)，其酶活性幾乎喪失。當(dāng)溫度達(dá)到 70左右時(shí)，其酶活性消失。 3.3.2 溫度對(duì)發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶的影響淀粉酶同工酶的影響 第 15 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.5 溫度對(duì)發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影響 如圖 3.5 所示，不同溫度下的“北京 553”淀粉酶同工酶譜帶。從圖中可以 看出：在 0條件下，其淀粉酶活性很弱；在 40時(shí)其活性最強(qiáng)，即最適溫度 為 40；當(dāng)溫度上升到 60時(shí)，其活性大大降低；當(dāng)溫度達(dá)到 70時(shí)，酶基本 失活。 3.4 淀粉酶同工酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 3.4.1 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 第 16 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.6 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 如圖 3.6 所示， “徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性酶譜帶。從圖中可以看 出：在 060條件下， “徐薯 18”淀粉酶同工酶很穩(wěn)定。當(dāng)溫度高于 70時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶同工酶極不穩(wěn)定。 3.4.2 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 圖圖 3.7 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 第 17 頁(yè) 共 31 頁(yè) 如圖 3.7 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)熱穩(wěn)定性酶譜帶。從圖中可以看 出：在 045溫度條件下，淀粉酶同工酶都很穩(wěn)定；60溫度條件其穩(wěn)定性 有所下降；70時(shí)“北京 553”淀粉酶同工酶很不穩(wěn)定；尤其當(dāng)溫度上升到接近 80時(shí)， “北京 553”淀粉酶同工酶極不穩(wěn)定。 3.5 甘薯甘薯“徐薯徐薯 18”淀粉酶活性存在的淀粉酶活性存在的 pH 值范圍值范圍 3.5.1 淀粉酶活性存在的極低淀粉酶活性存在的極低 pH 值值 圖圖 3.8 pH1.0pH5.29 條件下淀粉酶活性隨 pH 值的變化 如圖 3.8 所示，從圖中所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知：在 pH1.0、pH2.0 和 pH3.0（即 pH 值低于 3.0）時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶失活；而在 pH4.4 時(shí)， “徐薯 18” 淀粉酶活性卻存在。故可得出結(jié)論：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的極低 pH 值為 pH3.0pH4.4。 3.5.2 淀粉酶活性存在的極高淀粉酶活性存在的極高 pH 值值 第 18 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.9 pH5.29pH9.0 條件下淀粉酶活性隨 pH 值的變化 如圖 3.9 所示，從圖中所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知：在 pH8.04 和 pH9.0（即 pH 值高于 8.04）時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶失活；而在 pH7.73 時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶活性 雖 然非常微弱，但卻仍然存在。故可得出結(jié)論：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的極高 pH 值為 pH7.73pH8.04。 根據(jù)圖 3.8 和圖 3.9 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論：“徐薯 18”淀粉酶活性存在的 pH 值范圍大致為 pH4.0pH8.0。 3.6 pH 對(duì)淀粉酶同工酶的影響對(duì)淀粉酶同工酶的影響 3.6.1 pH 對(duì)發(fā)芽對(duì)發(fā)芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響淀粉酶同工酶的影響 第 19 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.10 pH 值對(duì)“徐薯 18”淀粉酶同工酶的影響 從圖 3.10 所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：當(dāng) pH 值低于 3.0 和高于 8.3 時(shí)， “徐 薯 18”淀粉酶失活；“徐薯 18”淀粉酶最適 pH 為 pH5.2pH6.0；當(dāng) pH 上升到 7.0 時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶活性大大降低；當(dāng) pH 值達(dá)到 7.7 時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶活 性非常弱，趨于失活。 3.6.2 pH 值對(duì)發(fā)芽值對(duì)發(fā)芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶的影響淀粉酶同工酶的影響 圖圖 3.11 pH 值對(duì)發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶的影響 第 20 頁(yè) 共 31 頁(yè) 從圖 3.11 所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：甘薯“北京 553”中的淀粉酶在 pH5.2pH6.5 條件下活性很強(qiáng)，其最適 pH 在 5.26.5 之間。而當(dāng) pH 為 3.0 時(shí)， 甘薯“北京 553” 淀粉酶活性已相當(dāng)?shù)?；?dāng) pH 值上升到 9.0 時(shí)，其酶活性基本 喪失。 3.7 淀粉酶同工酶的淀粉酶同工酶的 pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 3.7.1 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 圖圖 3.12 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 如圖 3.12 所示， “徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)酶譜帶。從圖中 所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：當(dāng)所處環(huán)境 pH 值低于 1.0（包括 1.0）和高于 10.0（包括 10.0）時(shí)， “徐薯 18”淀粉酶極不穩(wěn)定；pH 值為 2.0 和 9.0 時(shí)，淀粉酶 穩(wěn)定性下降；在 pH3.0pH8.0 之間，淀粉酶穩(wěn)定性較好，即比較穩(wěn)定。 3.7.2 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 第 21 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.13 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 如圖 3.13 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶對(duì) pH 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)酶譜帶。從圖中 所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：當(dāng)環(huán)境 pH 值低于 1.0（包括 1.0）和高于 10.0（包括 10.0）時(shí)， “北京 553”淀粉酶很不穩(wěn)定；在 pH2.0，pH3.0，pH7.0，pH8.0，pH9.0 條件下，淀粉酶比較穩(wěn)定；在 pH4.0pH6.0 條件下，淀粉酶最穩(wěn)定。 3.8 淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子的敏感性淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子的敏感性 3.8.1 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“徐薯徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn) 圖圖 3.14 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn) 第 22 頁(yè) 共 31 頁(yè) 從圖 3.14 所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：Ca2+不影響淀粉酶同工酶活性；Zn2+ 和 Cu2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用較??；Pb2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制 作用較大；而 Hg2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用很大，完全抑制了酶活性。 3.8.2 發(fā)芽發(fā)芽 7 天的天的“北京北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn)淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn) 圖圖 3.15 發(fā)芽 7 天的“北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn) 如圖 3.15 所示， “北京 553”淀粉酶同工酶對(duì)金屬離子敏感性實(shí)驗(yàn)酶譜帶。從 圖中所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：Ca2+不影響淀粉酶同工酶活性；Zn2+和 Cu2+對(duì)淀 粉酶同工酶活性的抑制作用較??；Pb2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用較大； 而 Hg2+對(duì)淀粉酶同工酶活性的抑制作用很大，幾乎完全抑制了淀粉酶活性。 3.9 酯酶同工酶酶譜分析酯酶同工酶酶譜分析 第 23 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.16 發(fā)芽 7 天的“徐薯 18”和“北京 553”不同部位的酯酶同工酶分析 左半部分和右半部分的“芽”、 “根”和“莖”分別代表加入的樣品酶液分別為發(fā)芽 7 天的甘 薯“徐薯 18”和“北京 553”的“根提取酶液” 、 “芽提取酶液” 和“莖提取酶液”。 如圖 3.16 所示， “徐薯 18”和“北京 553”酯酶同工酶酶譜帶。圖中左半部分 分別為“徐薯 18”的芽、根、莖中的酯酶同工酶酶譜帶；圖中右半部分分別為“北 京 553”的芽、根、莖中的酯酶同工酶酶譜帶。從圖中可以看出：無(wú)論是“徐薯 18”還是“北京 553”，它們的根酶液電泳圖譜中均未出現(xiàn)酯酶同工酶譜帶,說(shuō)明它 們的根中幾乎不含有酯酶；它們的芽酶液電泳圖譜中出現(xiàn)了 4 條同工酶譜帶,說(shuō) 明它們的芽中含有 4 種酯酶同工酶；甘薯莖酶液電泳圖譜中的 5 條同工酶譜帶 意味著其莖中含有 5 種酯酶同工酶。 從圖 3.16 中所示結(jié)果還可以得知，甘薯莖中的酯酶同工酶活性遠(yuǎn)大于其牙 和根中的酯酶同工酶活性。在甘薯莖酶液電泳圖譜中，前面 2 條帶很大而且顏 色深，說(shuō)明甘薯莖中的兩種分子量較小的酯酶同工酶活性更強(qiáng)一些。 3.10 蛋白水解酶同工酶酶譜分析蛋白水解酶同工酶酶譜分析 第 24 頁(yè) 共 31 頁(yè) 圖圖 3.17 發(fā)芽 7 天的甘薯不同部位的蛋白水解酶同工酶分析 “根”、 “芽”和“莖”分別代表加入的樣品酶液分別為發(fā)芽 7 天的甘薯的“根提取酶液” 、 “芽 提取酶液” 和“莖提取酶液”。 蛋白水解酶同工酶酶譜帶，如圖 3.17 所示。甘薯根的電泳圖譜中出現(xiàn)了一 條細(xì)細(xì)的蛋白酶譜帶，而且這條帶的相對(duì)遷移率很小，說(shuō)明在甘薯的根中存在 一種分子量較大的蛋白水解酶，但其活性較弱；在甘薯芽的電泳圖譜中出現(xiàn)了 6 條蛋白酶譜帶，而且此 6 條蛋白酶譜帶都比較寬大，說(shuō)明甘薯芽中有 6 種蛋 白水解酶同工酶，而且活性比較強(qiáng)；在甘薯莖的電泳圖譜中出現(xiàn)了 8 條蛋白酶 譜帶，而且很寬，說(shuō)明在甘薯的莖中有 8 種蛋白水解酶同工酶，而且其活性很 強(qiáng)。 第 25 頁(yè) 共 31 頁(yè) 4 討論討論 由于甘薯中主要的儲(chǔ)藏物質(zhì)為淀粉，淀粉的降解代謝是其發(fā)芽過(guò)程中的關(guān) 鍵步驟，因而淀粉酶的表達(dá)與調(diào)控必然在甘薯的發(fā)芽過(guò)程中起著重要作用。淀 粉酶的表達(dá)與調(diào)控，淀粉酶活性的強(qiáng)弱，很大程度地影響甘薯的發(fā)芽反應(yīng)過(guò)程。 所以，我們主要對(duì)甘薯淀粉酶同工酶的特性進(jìn)行了研究。分析了不同溫度、不 同 pH 值以及不同的金屬離子對(duì)淀粉酶同工酶活性的影響。本文以兩個(gè)甘薯品 種為材料再次對(duì)淀粉酶、酯酶和蛋白酶三個(gè)主要的水解酶的同工酶特性進(jìn)行研 究。通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)后的甘薯的芽和根中的淀粉酶含量極少，芽中的 酯酶和蛋白酶含量也不多，根中的酯酶和蛋白酶含量極少，難以檢測(cè)到。由于 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物酯酶和蛋白酶的研究所取得的成果不多，對(duì)植物酯酶和蛋白 酶研究方法的相關(guān)報(bào)道也比較少。尤其是甘薯中的蛋白酶，目前還未找到成熟 有效的實(shí)驗(yàn)研究方法。再者，酯酶和蛋白酶含量